HBV pre-c-Fc融合蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc蛋白(HBV precore protein-mouse IgG Fc，HBV pre-c-Fc)，擴(kuò)增桿狀病毒。在Sf9細(xì)胞中表達(dá)，探索表達(dá)的最佳條件，純化得到純度高的蛋白，通過免疫BALB/c小鼠鑒定其免疫原性。
　　方法:目的基因HBV pre-c-Fc連接到pFastBac1載體，獲得的pFastBac1-HBVpre-c-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Ba

2、c感受態(tài)，通過Tn7轉(zhuǎn)座子將目的基因轉(zhuǎn)座到Bacmid中，得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭載體，脂質(zhì)體包被后轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞獲得P1代病毒，重復(fù)轉(zhuǎn)染Sf9獲得高滴度病毒。為了提高蛋白的產(chǎn)量，確定MOI前提下收獲36，48，60，72，84，96，108，120小時(shí)收獲細(xì)胞上清，通過Western Blot方法鑒定并確定最佳的收獲時(shí)間;再在最佳收獲時(shí)間前提下，設(shè)置MOI為1，2，4，8，16，32收獲細(xì)胞上清，通過West

3、ern Blot方法鑒定并確定最佳的病毒濃度。在最佳時(shí)間和最佳病毒濃度下收集細(xì)胞上清超濾后通過Protein G親和層析柱純化得到目的蛋白HBV pre-c-Fc。純化的蛋白大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射免疫BALB/c小鼠并檢測(cè)血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體產(chǎn)生量。
　　結(jié)果:HBV pre-c-Fc在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)，純化后蛋白純度達(dá)90％以上，蛋白產(chǎn)量約為3.03mg/L，純化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生特異抗體。
　　結(jié)論