中藥組方NDRF聯合MTX對AA家兔抗炎及免疫調節(jié)研究.pdf

1、目的：
　　①改良家兔佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型,為 AA家兔實驗性治療提供良好的動物模型;
　?、谝灾兴?NDRF組方單獨及聯合甲氨蝶呤對 AA家兔進行干預,觀察其抗炎癥及改善骨關節(jié)損傷實驗效果,以期對炎癥機制及抗炎癥治療提供指導;
　?、垡灾兴?NDRF組方單獨及聯合甲氨蝶呤對 AA家兔進行干預,觀察其調節(jié)CD4+CD25+Treg細胞及Th1/Th2細胞因子變化,探討免疫耐受在

2、AA致病機制中的作用。
　　方法：
　?、僖訡FA聯合TNF-α為誘導劑,第一方案采用10天2次7點注射,第二方案采用14天3次9點注射進行改良制備AA家兔模型;
　?、谟^察家兔活動、進食等一般情況和關節(jié)腫脹情況,測量體重、體溫及膝關節(jié)周徑的變化,以關節(jié)炎指數作為判定模型標準,同時增加炎性細胞因子、病理學與X影像學的指標觀察;
　　③采用ELISA法檢測家兔血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-

3、10、TGF-β和滑膜液中MMP-1、MMP-9細胞因子的水平;
　?、懿捎?RT-qPCR法檢測家兔滑膜組織 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA及 MMP-1 mRNA的水平;
　?、莶捎妹庖呓M化法檢測家兔滑膜組織TNF-α、IL-1β的含量變化;
　?、藜彝藐P節(jié)滑膜組織標本用HE染色觀察組織病理變化;
　?、逥R X線機對家兔后肢進行攝片,以X線影像學方法觀察家兔骨關節(jié)變化及評分,判斷骨關節(jié)的損傷程度

4、;
　?、嗖捎昧魇郊毎g檢測家兔外周血CD4+CD25+Treg細胞的變化。
　　結果：
　?、俚谝环桨讣彝迷炷?1天時關節(jié)炎指數大于6,第二方案家兔造模18天時關節(jié)炎指數大于6;右膝關節(jié)周徑在兩個方案第一周均增大明顯,與注射前比較,p<0.05差異有統(tǒng)計學意義;左膝關節(jié)周徑第一方案第21天增大明顯,第二方案在第16天增大明顯,分別與注射前比較,p<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　?、谀Ｐ驮黾又笜擞^察:家兔造模21

5、天ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著高于造模前;家兔滑膜液中MMP-1、MMP-9含量均顯著高于造模前;滑膜組織TNF-α、IL-1β的表達模型組強陽性,正常組為陰性;X線影像正常組與模型組比較,骨侵蝕評分、關節(jié)間隙評分及骨關節(jié)間隙測量值均有差異;病理學觀察模型組家兔皮下組織有明顯紅腫,甚至潰爛,關節(jié)腔間隙變窄,關節(jié)腔內可見明顯滑膜腫脹增厚,可見大量淋巴細胞、巨噬細胞及嗜酸性細胞等慢性炎細胞浸潤。
　?、蹖嶒炐?/p>

6、治療后家兔 ELISA法細胞因子檢測結果:家兔滑膜液中 MMP-1、MMP-9中藥NDRF組與聯合治療組下降明顯,與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計學意義;實驗性治療后家兔血清 IL-10、TGF-β、IL-4含量不同程度升高,中藥組升高明顯,與模型組比較p<0.05有差異。實驗性治療后家兔血清IFN-γ含量下降,中藥組下降明顯,與模型組比較p<0.05有差異。
　?、軐嶒炐灾委熀蠹彝没そM織TNF-αmRNA、IL-1βmRNA及

7、MMP-1 mRNA相對定量統(tǒng)計分析mRNA(2-(??Ct)值):TNF-αmRNA結果中藥NDRF組和聯合組比模型組均明顯降低,p<0.05有顯著性差異;IL-1βmRNA結果中藥NDRF組和聯合組比模型組均明顯降低,p<0.05有顯著性差異;MMP-1 mRNA結果中藥NDRF組和聯合組比模型組均明顯降低,p<0.05有顯著性差異。
　?、輰嶒炐灾委熀蠹彝孟リP節(jié) X線影像學觀察:造模組骨侵蝕評分與骨關節(jié)間隙評分明顯升高,關節(jié)

8、間隙縮小。治療后各治療組均有不同程度恢復,骨侵蝕評分中藥組、聯合組分別與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計學差異,骨關節(jié)間隙評分聯合組與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計學差異;骨關節(jié)間隙測量中藥組、聯合組分別與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計學差異。
　　⑥實驗性治療后家免疫組化結果:聯合組家兔關節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β的表達水平和表達強度與模型組比較明顯降低,兩組比較p<0.05有統(tǒng)計學差異;中藥組家兔關節(jié)滑膜組織TNF-α、I

9、L-1β的表達水平和表達強度與模型組比較有所降低,但表達水平與模型組比較經統(tǒng)計學分析p>0.05無差異,表達強度與模型組比較,兩組比較p<0.05有統(tǒng)計學差異。
　　⑦T細胞亞群流式細胞術檢測結果:模型組家兔外周血 CD4+CD25+Treg細胞百分率明顯低于正常對照組,兩組比較p<0.05有統(tǒng)計學差異;治療后中藥NDRF百分率升高,與模型組比較p<0.05有統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　?、俦緦嶒災Ｐ椭苽浣Y果:CFA聯

10、合TNF-α為誘導劑,第一方案采用10天分2次7點注射,結果成模率78％,21天關節(jié)炎指數大于6;第二方案采用14天分3次9點注射,結果成模率83%,18天關節(jié)炎指數大于6;AA家兔模型增加炎性細胞因子含量、病理學改變及膝關節(jié)X線影像學改變情況觀察,結果均有異常,表明AA模型成功。
　　②本研究實驗性治療結果,中藥 NDRF及聯合 MTX可降低 AA家兔滑膜液MMP-1、MMP-9細胞因子水平;中藥NDRF及聯合MTX可降低AA家

11、兔滑膜組織TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、MMP-1m RNA水平;通過下調TNF-α、IL-1β、MMP-1、MMP-9水平,發(fā)揮抑制致炎效應和改善骨關節(jié)的損傷。
　　③本研究對實驗性治療家兔進行X線影像學觀察,結果X片顯示中藥NDRF及聯合MTX治療后家兔膝關節(jié)界限清晰,關節(jié)面較光滑,關節(jié)間隙狹窄有一定程度改善,病變程度有所減輕,經骨侵蝕評分、骨關節(jié)間隙評分和關節(jié)間隙測量,結果治療組均較模型組好,值得深入研究。