銀屑病皮損及缺氧條件下HaCaT細胞HIF-1α與血管生成相關蛋白表達關系的研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其組織病理學改變以角質(zhì)形成細胞過度增殖、新生血管形成、炎癥細胞浸潤為基本特征。目前認為銀屑病組織病理學改變的三大基本特征之間的關系密不可分，其中新生血管形成可能啟動了整個病理變化過程。目前對銀屑病的血管生成機制的研究已成為熱點，特別是一些血管生成相關因子日益受到重視。角質(zhì)形成細胞是促血管生成因子的主要來源之一，可分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor

2、，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfacto-α，TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)、內(nèi)皮細胞促血管生成因子、胸苷磷酸化酶和白介素-8(interleukin-8，IL-

3、8)等。其中VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強、最專一的直接促進血管生成的因子之一；iNOS則通過誘導生成NO，發(fā)揮促進血管生成等作用。
　　 微血管是皮膚組織與循環(huán)血液進行物質(zhì)交換的場所，當組織增生或其他因素超過了血管供應能力時，就將導致組織缺氧，這時機體感受O2濃度變化并對缺氧做出適應性反應，用以維持組織氧供并增強細胞在缺氧情況下的適應能力，其中最重要的低氧信號傳遞因子就是低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible fa

4、ctor1，HIF-1)，HIF-1是低氧時誘導基因表達和恢復細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個核心調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下，細胞產(chǎn)生的HIF-1與靶基因中的低氧反應元件(hypoxia responseelemet，HRE)結(jié)合并促進靶基因轉(zhuǎn)錄，引起一系列細胞對缺氧的適應性反應，對保持機體的氧穩(wěn)態(tài)，具有重要的病理生理學意義。
　　 最新的一些研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可能參與銀屑病的發(fā)生與發(fā)展。HIF-1α是調(diào)節(jié)HIF-1活性的功能亞單位，在缺氧條件下，它

5、穩(wěn)定存在并誘導如VEGF和iNOS等靶基因的表達。因此，我們推測在銀屑病中是否存在缺氧誘導了HIF-1α的表達，進而調(diào)控一些與血管生成相關靶基因如：VEGF和iNOS的表達并參與銀屑病的新生血管形成，從而在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程起著重要作用。我們擬通過三個部分的研究來證實：1.銀屑病皮損中HIF-1α與血管生成相關蛋白表達的關系；2.低氧培養(yǎng)HaCaT細胞中HIF-1α與血管生成相關蛋白表達的關系；3.抑制HIF-1α的表達對低氧條件下

6、培養(yǎng)HaCaT細胞血管生成相關蛋白表達的影響。通過這些研究試圖揭示HIF-1α在銀屑病的新生血管形成機制中的作用，并為銀屑病的治療尋找有效的新途徑提供理論依據(jù)。
　　 第一部分、銀屑病皮損中HIF-1α與血管生成相關蛋白的表達
　　 目的：探討HIF-1α、VEGF、iNOS在進行期尋常型銀屑病皮損及非皮損中的表達，并分析它們的相關性，同時分析其與銀屑病血管增生的相關性。
　　 方法：采用免疫組織化學SABC法和

7、蛋白印跡法檢測32例進行期尋常型銀屑病患者皮損組織、非皮損組織和20例正常人皮膚組織中HIF-1α、VEGF和iNOS的蛋白表達水平，并采用圖像分析技術對其表達進行定量分析，同時用CD34標記血管內(nèi)皮細胞，計算皮膚組織中的微血管密度(MVO)。
　　 結(jié)果：銀屑病患者皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表達的平均積分吸光度值分別為86.96±2.56、95.81±2.74、90.01±2.77，MVD為33.80±4.

8、15；非皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表達的平均積分吸光度值分別為30.14±7.77、44.32±9.06、48.76±10.08，MVD為17.16±3.54；正常人皮膚組織中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表達的平均積分吸光度值分別為29.15±7.08、34.±13.82、37.33±3.13，MVD為18.48±3.67。經(jīng)統(tǒng)計學分析，銀屑病患者組皮損組織中三者的表達與MVD均高于非皮損組織和正常人皮膚組織

9、(P<0.01)，而銀屑病患者非皮損組織與正常人皮膚組織相比，差異無顯著性(P>0.05)。銀屑病患者組皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表達均與MVD呈顯著正相關(r=0.947，P<0.01；r=0.859，P<0.01；r=0.899，P<0.01)；銀屑病患者組皮損組織中HIF-1α蛋白的表達與VEGF及iNOS蛋白的表達亦呈明顯正相關(r=0.817，P<0.01；r=0.873，P<0.01)；蛋白印跡法檢

10、測銀屑病患者組皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表達的平均值分別為0.76±0.068、1.21±0.131、0.96±0.045，非皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表達的平均值分別為0.42±0.081、0.78±0.062、0.44±0.046，20例正常對照者皮膚組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表達的平均值分別為0.32±0.093、0.73±0.098、0.43±0.098。上述結(jié)

11、果顯示銀屑病患者皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表達水平均顯著高于正常對照組(P均<0.01)，而非皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表達水平與正常對照組比較無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，與免疫組織化學檢測結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：進行期尋常型銀屑病皮損組織中存在HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白的過表達，三者在促進銀屑病新生血管生成中具有協(xié)同作用，可能在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作

12、用。
　　 第二部分、缺氧條件下HaCaT細胞HIF-1α與血管生成相關蛋白表達的研究
　　 目的：研究缺氧條件下角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA及蛋白的表達。
　　 方法：分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)HaCaT細胞，培養(yǎng)4、8、12、24h后，收集細胞，提取細胞總RNA和蛋白，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(real time RT-PCR)及Western blot技術

13、檢測各組HaCaT細胞中HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA及蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：低氧條件下與常氧條件下培養(yǎng)HaCaT細胞的HIF-1α mRNA表達水平比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但HIF-1α蛋白表達水平在低氧條件下較常氧條件下有顯著增高(P<0.01)。低氧條件下與常氧條件下培養(yǎng)HaCaT細胞的VEGF、iNOSmRNA和蛋白表達水平比較均顯著增高(P<0.01)。
　　 結(jié)論：1)低氧對HaC

14、aT細胞HIF-1α mRNA的表達調(diào)控無明顯作用，但使HIF-1α蛋白的表達明顯上調(diào)。2)低氧對HaCaT細胞的VEGF及iNOS mRNA和蛋白的表達水平明顯上調(diào)。
　　 第三部分、HIF-1α小干擾RNA對HaCaT細胞血管生成相關蛋白表達的影響
　　 目的：探討HIF-1α-siRNA對低氧條件下培養(yǎng)HaCaT細胞的HIF-1α、VEGF和iNOSmRNA及蛋白表達水平的影響。
　　 方法設計并合成針對H

15、IF-1α的特異性小干擾RNA，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細胞，同時設轉(zhuǎn)染對照組，分別在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)24h后，提取細胞總RNA和蛋白，采用real time RT-PCR和Western-blot方法檢測HIF-1α、VEGF和iNOSmRNA及蛋白表達水平的變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的HaCaT細胞低氧培養(yǎng)24h后，HIF-1α、VEGF和iN