幽門螺桿菌尿素酶B亞單位HLA限制性CD4+T細胞表位的篩選與鑒定.pdf

1、[背景和目的]
　　全球50％以上的人群存在著幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)的感染,其感染與胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)和胃癌等疾病的發(fā)生密切相關。面對H.pylori的高感染率和嚴重的致病性,國內外已廣泛開展H.pylori疫苗研究。然而,現(xiàn)有疫苗的免疫保護效果都十分有限?全菌疫苗的抗原組成復雜,誘發(fā)的免疫應答混亂,甚至包含有害的反應;一些亞單位疫苗在動物模型上取得

2、了很好的實驗結果,卻因人與實驗動物MHC分子差異,導致臨床實驗的失敗?表位疫苗是基于誘發(fā)免疫應答最基本的功能單位——表位來設計的疫苗。通過控制表位的組成能夠精確控制疫苗所誘發(fā)的免疫應答類型。與傳統(tǒng)疫苗相比,其更加高效,針對性更強。目前,已廣泛應用于感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病的疫苗設計研發(fā)之中。
　　表位的篩選和鑒定是表位疫苗研制的關鍵。研究表明在抗H.pylori感染的保護性免疫應答中,CD4+T淋巴細胞發(fā)揮著重要作用。

3、同時,相對于亞優(yōu)勢表位和隱性表位,只有免疫優(yōu)勢表位才能夠誘發(fā)最為強烈的免疫應答。因此,免疫優(yōu)勢CD4+T細胞表位是H.pylori表位疫苗所必須的。
　　尿素酶B亞單位(Ureasesubunitbeta,UreB)作為H.pylori重要的定植因子和毒力因子,具有較高的保守性和較強的免疫原性,小鼠實驗證實其具有很好的免疫保護效果,被認為是最佳的疫苗候選抗原之一。本課題組前期已經鑒定出3個UreB來源的小鼠H-2d限制性CD4+T

4、細胞表位,用這些表位組成的表位疫苗能夠顯著降低幽門螺桿菌在胃內的定植數(shù)量。然而,由于人與小鼠MHC分子的差異,這些表位很難在人體中誘發(fā)免疫優(yōu)勢CD4+T細胞應答。因此,本研究擬對UreB來源的HLA限制性CD4+T細胞免疫優(yōu)勢表位進行篩選鑒定,為H.pylori表位疫苗的設計提供候選表位。
　　[方法]
　　通過13C尿素呼氣實驗和血清學ELISA實驗篩選H.pylori感染陽性患者,收集患者外周血單個核細胞,利用重組的Ur

5、eB蛋白對H.pylori感染者外周血中UreB特異性CD4+T淋巴細胞進行體外擴增;再通過步移重疊合成肽法對這些特異性CD4+T細胞所識別的免疫優(yōu)勢表位進行系統(tǒng)的篩選和鑒定。通過HLA-II類分子抗體阻斷法對表位的限制性主型進行分析,再利用帶有不同HLA-II類分子亞型的BLCL表位遞呈實驗對表位的限制性亞型進行鑒定。最后,通過樹突細胞負載重組UreB蛋白或H.pylori全菌抗原對表位的自然遞呈特性進行鑒定。
　　[結果]

6、r>　　1、通過13C尿素呼氣實驗和血清學ELISA實驗篩選出兩個H.pylori感染陽性患者,樣本編號分別為4529和4493。
　　2、通過重組UreB抗原體外刺激擴增后,4529和4493個體來源的PBMC中UreB特異性CD4+T細胞頻率分別為2.34%和1.64%。
　　3、步移重疊18mer肽篩選顯示4529和4493個體來源的UreB特異性CD4+T細胞識別的優(yōu)勢表位分別位于UreB373–390和UreB43

7、9-456區(qū)域。
　　4、步移重疊13mer肽和截短肽段篩選顯示免疫優(yōu)勢表位的核心序列在4529和4493個體中分別為UreB373–385和UreB438–452。
　　5、通過抗體阻斷分析顯示這兩個免疫優(yōu)勢表位均屬于HLA-DR限制性。
　　6、不同HLA亞型BCL表位遞呈實驗分析顯示表位UreB373–385限制性亞型為DRB1*1404,表位UreB438–452的限制性亞型為DRB1*0803。
　　7

8、、體外自然遞呈實驗證實,兩個新的免疫優(yōu)勢表位的特異性T細胞均能識別負載重組UreB抗原或幽門螺桿菌全菌細胞裂解物的自體DC細胞。
　　[結論]
　　本研究從幽門螺桿菌UreB抗原中篩選鑒定到兩個新的HLA限制性免疫優(yōu)勢CD4+T細胞表位:DRB1*1404限制性的UreB373–385和DRB1*0803限制性的UreB438–452。這兩個表位均能被抗原遞呈細胞自然加工遞呈,這將為H.pylori表位疫苗的設計提供候選表位