棉鈴蟲Bt受體鈣粘蛋白的免疫組織化學及Cry1Ab毒素在氨肽酶N上的結(jié)合區(qū)定位.pdf

1、Bt毒素是防治農(nóng)業(yè)害蟲的重要的生物農(nóng)藥。當利用轉(zhuǎn)Bt基因棉花進行害蟲治理時，化學農(nóng)藥已經(jīng)有很大程度的減少，同時某些昆蟲也出現(xiàn)了對Bt的抗性，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重的威脅。目前，Bt毒素的作用機理和抗性機制還不是很清楚。 CrylAb和CrylAc毒素都能結(jié)合棉鈴蟲中腸上皮細胞的鈣粘蛋白(Cadherin-like protein)和氨肽酶N(AminopeptidaseN，APN)，目前，CrylA毒素與中腸上受體的作用機制還不是很

2、清楚，為了進一步了解毒素與中腸受體之間的相互作用，在本論文中，利用免疫組織化學的方法分析了鈣粘蛋白在中腸上皮細胞的組織水平上的定位，并比較了敏感品系和抗性品系的棉鈴蟲中腸上皮鈣粘蛋白的免疫定位。此外，通過大腸桿菌表達的不同長度的氨肽酶N片段，利用Western blot技術(shù)來確定CrylAb毒素在結(jié)合區(qū)的定位。利用高碘酸氧化的方法確定氨肽酶N的糖基化對其與CrylAb和CrylAc毒素結(jié)合的影響。 主要結(jié)果如下：鈣粘蛋白是位于中

3、腸上皮細胞的微絨毛的頂部，并且在整個中腸均勻分布，在中腸上皮的底膜也有分布。此外，在細胞質(zhì)中有微弱的染色，這表明鈣粘蛋白在細胞質(zhì)的反面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成后，向微絨毛的頂端動態(tài)運輸。從棉鈴蟲敏感品系和抗性品系的免疫組織定位來看，鈣粘蛋白的免疫定位并沒有顯著的變化。這種分布模式也表明，毒素必須穿過圍食膜，然后才與鈣粘蛋白結(jié)合。同時也表明鈣粘蛋白的這種分布模式與Bt毒素的作用機制是一致的。不同長度的原核表達重組氨肽酶N片段與CrylAb毒素雜交表明

4、，至少存在有2個結(jié)合區(qū)，其中的一個結(jié)合區(qū)位于1 Met——329 Leu，而另一個結(jié)合區(qū)位于396 Val——517 Ala。通過分析APN氨基酸序列發(fā)現(xiàn)這兩個結(jié)合區(qū)都不包含“鋅結(jié)合位點<'375>ILSHEIAHMW<'384>”，這表明毒素結(jié)合APN是不依賴這種“鋅結(jié)合位點”結(jié)構(gòu)。大豆凝集素SBA雜交與配基雜交實驗表明，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)共價偶聯(lián)在120 kDa的APN上，高碘酸氧化處理雜交膜實驗表明，GaINAc是C