基于催化產(chǎn)氣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)放大方法及其在即時檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目前，在臨床診斷中的生化分析檢測基本都是基于光學(xué)、磁或電化學(xué)分析方法。這些方法雖然為人們提供了準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，但由于需要精密的大型儀器及專業(yè)的操作人員，增加了實驗復(fù)雜性和檢測成本，限制其推廣和應(yīng)用。與此同時，隨著科技的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對疾病的快速診斷和個性化治療提出了更高的要求，急切需要一種操作簡單、成本低廉、定量準(zhǔn)確、攜帶方便、用戶友好的檢測方法—即時檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。所謂即時檢測(Point of CareTestin

2、g，POCT)，是指在發(fā)病或者發(fā)生事件的地點進(jìn)行即時檢測和診斷，從而實現(xiàn)迅速的監(jiān)控和治療。
　　20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的核酸適體技術(shù)已得到越來越廣泛的應(yīng)用。由于核酸適體具有特異性高、親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、無免疫原性等一系列優(yōu)勢，已發(fā)展成為一種新型的分析診斷分子，在基礎(chǔ)研究、生化分析、藥物篩選和臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。基于此，本文通過核酸分子識別技術(shù)，構(gòu)建快速、靈敏、方便的新型即時檢測新裝置，用于無機(jī)離子、小分子、生物大分子例如蛋

3、白質(zhì)、DNA、甚至病毒、細(xì)菌、細(xì)胞等多種靶標(biāo)的高靈敏定量檢測。本論文的主要工作分為三個方面:
　　1、基于氣動芯片的便攜小分子檢測
　　水凝膠是一類通過共價鍵或非共價鍵交聯(lián)的，能響應(yīng)多種化學(xué)、物理刺激的三維親水性網(wǎng)狀聚合物。將核酸適體DNA作為嵌入物引入到水凝膠中，由于核酸適體本身具有的靶標(biāo)識別能力，可實現(xiàn)DNA水凝膠選擇性的識別靶標(biāo)分子，從而引起水凝膠的構(gòu)象改變，結(jié)合信號放大分子即可實現(xiàn)靶標(biāo)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)放大。本文以可卡因為模

4、型分子，在水凝膠中包埋鉑包金納米粒子，通過納米粒子催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣這一產(chǎn)氣反應(yīng)，證明所建立的氣動芯片(HV-Chip)可高靈敏定量檢測靶標(biāo)分子的可行性，同時實現(xiàn)靶標(biāo)可卡因低至0.06μM的檢測。我們所設(shè)計的氣動芯片，集靶標(biāo)解膠及信號讀取于一體，實現(xiàn)了復(fù)雜體系下可卡因的高靈敏檢測，且具有與標(biāo)準(zhǔn)方法LC/MS相同的精確度。作為一種廉價、快速、便攜的檢測新方法，HV-Chip一體化集成方法具有能夠代替標(biāo)準(zhǔn)方法的適宜性和可靠性。通過改變核酸

5、適體水凝膠中的DNA序列，實現(xiàn)靶標(biāo)腺苷的靈敏檢測，證明了該方法的通用性。
　　2、基于氣動芯片的高靈敏循環(huán)腫瘤細(xì)胞便攜檢測
　　CTCs檢測，對腫瘤的轉(zhuǎn)移、評估預(yù)后及患者的個體化治療具有重要意義。然而外周血中CTCs數(shù)量極少，因此急需建立一種檢測靈敏性、特異性及重復(fù)性高的檢測技術(shù)。由于細(xì)胞極小（直徑～10μm），樣品量很少（pL-fL），使得單細(xì)胞的研究極具挑戰(zhàn)。微流控技術(shù)，在過去的研究中，已被證明在單細(xì)胞研究中具有良好的尺

6、寸適應(yīng)性，該技術(shù)的出現(xiàn)，進(jìn)一步地推動了單細(xì)胞分析技術(shù)的發(fā)展。在文中，我們以人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞CCRF-CEM作為靶標(biāo)細(xì)胞，替代外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs，sgc8為CEM相對應(yīng)的核酸適體，基于核酸適體的特異性識別和氣動芯片(V-Chip)相結(jié)合，設(shè)計了一個簡單、通用的即時檢測系統(tǒng)，用于靶標(biāo)細(xì)胞的單細(xì)胞高靈敏檢測。通過在核酸適體上修飾信號放大分子鉑金包金納米粒子，藉由核酸適體可特異性結(jié)合靶標(biāo)這一特點，將納米粒子特異性引入到

7、靶標(biāo)細(xì)胞中，最終實現(xiàn)單個靶標(biāo)細(xì)胞CCRF-CEM的高靈敏分析及高背景下靶標(biāo)細(xì)胞CCRF-CEM的檢測，證明該方法具有檢測CTC的適宜性。
　　3、基于壓力傳感的便攜檢測新方法
　　到目前為止，光學(xué)、磁、質(zhì)譜和電化學(xué)方法等仍然是實驗室中研究較為成熟的技術(shù)。但是，若要將這些技術(shù)用于野外工作或POC檢測，必須克服環(huán)境干擾大、成本高、體積大或操作繁瑣等一系列困難。為了克服這些局限性，如何實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并可簡易輸出是目前科學(xué)家們的研究熱

8、點。在本文中，我們將鉑納米粒子包埋的DNA核酸適體水凝膠與生活中已廣泛使用的氣壓計相結(jié)合(PASS-Gel)，以靶標(biāo)可卡因為模型分子，構(gòu)建了一種快速、簡便、便攜且成本低的定量檢測新方法。該方法實現(xiàn)了對低至0.12μM可卡因分子的檢測，具有與標(biāo)準(zhǔn)方法LC/MS相同的精確度和可靠性，且由于檢測設(shè)備體積小，結(jié)構(gòu)簡單，能適應(yīng)更多檢測環(huán)境和要求。為了驗證方法的通用性，設(shè)計了針對重金屬離子Pb2+和毒素分子-赭曲霉素OTA檢測的核酸適體水凝膠，實現(xiàn)