JNK-MAPK在聯(lián)合藥物預(yù)處理對(duì)在體大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、背景： 缺血預(yù)處理是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌保護(hù)措施，但其確切機(jī)制尚未清楚，在臨床應(yīng)用中亦存在諸多不便，且會(huì)造成新的損傷。人們?cè)谌毖A(yù)處理研究基礎(chǔ)之上，嘗試?yán)盟幬锬M這種內(nèi)源性抗損傷能力，從而達(dá)到心肌保護(hù)效果，稱為藥物預(yù)處理。藥物預(yù)處理已經(jīng)成為心肌保護(hù)研究的熱點(diǎn)，研究表明許多藥物如腺苷、一氧化氮、緩激肽、嗎啡和去甲腎上腺素以及ATP敏感鉀通道（KATP）開(kāi)放劑等均可以模擬缺血預(yù)處理產(chǎn)生心臟保護(hù)作用。缺血預(yù)處理的作用機(jī)制非常復(fù)

2、雜，激活缺血預(yù)處理機(jī)制涉及很多觸發(fā)因子，每個(gè)觸發(fā)因子對(duì)激活缺血預(yù)處理機(jī)制起協(xié)同疊加作用，然而當(dāng)它們?cè)诖罅酷尫艜r(shí)對(duì)細(xì)胞卻又有害。模擬單個(gè)因子的藥物預(yù)處理難以控制其有效劑量與中毒劑量，在臨床藥物預(yù)處理的研究中重復(fù)性差，如腺苷和去甲腎上腺素單獨(dú)應(yīng)用都可以成功誘導(dǎo)預(yù)處理效應(yīng)，但腺苷會(huì)引起血壓劇烈下降，心率減慢；去甲腎上腺素會(huì)引起血壓劇烈升高，心率增快。目前的藥物預(yù)處理研究仍局限于模擬單個(gè)觸發(fā)因子的缺血預(yù)處理樣心肌保護(hù)作用。我們?cè)O(shè)想，聯(lián)合使用多個(gè)

3、藥物模擬缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，與單個(gè)藥物相比，因聯(lián)合藥物間的疊加作用，可能會(huì)降低副作用的發(fā)生，藥物安全有效劑量范圍也可能大為擴(kuò)展。對(duì)其機(jī)制的研究涉及一氧化氮（No）、活性氧簇（ROS）、KATP通道、G蛋白藕聯(lián)受體、蛋白激酶C、蛋白酪氨酸激酶、絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）等多種物質(zhì)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 目的： 本實(shí)驗(yàn)采用在體大鼠心臟缺血再灌注模型，內(nèi)容共分兩部分：第一部分初步研究聯(lián)合應(yīng)用腺苷、去甲腎上腺素、緩激肽模擬缺

4、血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。初步研究聯(lián)合藥物預(yù)處理擴(kuò)展藥物安全劑量范圍，提高藥物安全性。第二部分觀察JNK/MAPK在腺苷、去甲腎上腺素、緩激肽預(yù)處理后缺血再灌注心肌的表達(dá)及作用，進(jìn)一步探討JNK/MAPK在聯(lián)合藥物預(yù)處理保護(hù)中的作用及機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分初步研究聯(lián)合應(yīng)用腺苷、去甲腎上腺素、緩激肽模擬缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。 SD大鼠54只，隨機(jī)分為9組，每組6只。 （1）A：缺血再灌注組（空白對(duì)

5、照組） （2）B：缺血預(yù)處理組（陽(yáng)性對(duì)照組） （3）C：腺苷組 （4）D：去甲腎上腺素組 （5）E：緩激肽組 （6） F1：腺苷+去甲腎上腺素組 （7）F2：腺苷+緩激肽組 （8） F3：緩激肽+去甲腎上腺素組 （9）G：腺苷+緩激肽+去甲腎上腺素組 建立在體大鼠缺血再灌注損傷模型，各處理組先分別行缺血或藥物預(yù)處理，間隔10min后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支缺血30min

6、、再灌注120min。由生理多導(dǎo)連續(xù)觀察血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，給藥前、缺血前、缺血10min、缺血30min、再灌注后30min、60min、120min時(shí)心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（IVEDP）、左心室收縮壓最大上升速率（+dp/dt max）、左心室舒張壓最大下降速率（—dp/dt max），經(jīng)右心房采血，分離血清后檢測(cè)肌鈣蛋白T（cTnT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）。 第二部分觀察JNK

7、/MAPK在聯(lián)合藥物預(yù)處理后缺血再灌注心肌的表達(dá)及作用 根據(jù)第一部分的實(shí)驗(yàn)分組，各組在再灌注末剪下左心室心尖部心肌組織，一部分作石蠟切片，免疫組織化學(xué)檢測(cè)PKC；一部分立即置于液氮中冷凍保存，Western—blotting半定量分析MKK4、JNK3、c—Jun的活性變化；RT—PCR法觀察MKK4、JNK3、c—Jun mRNA的含量變化。 結(jié)果： 第一部分： 1、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) HR在缺血

8、10min—30min時(shí)達(dá)到高峰，再?gòu)?fù)灌后逐漸減慢到給藥前水平，甚至更低。各組在給藥前HR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；缺血前D去甲腎上腺素組HR偏慢；缺血10min—30min各組HR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；再灌注30min—60min各組HR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；再灌注120min F1腺苷+去甲腎上腺素組和G腺苷+緩激肽+去甲腎上腺素組較A缺血再灌注組偏快（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 LVSP在缺血10

9、min—30min時(shí)逐漸走低，在復(fù)灌30min后逐漸緩慢上升，但遠(yuǎn)低于給藥前水平。各組在給藥前LVSP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；缺血前D去甲腎上腺素組LVSP偏高；缺血10min—30min各組LVSP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；再灌注30min—60min各組LVSP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；再灌注120min F1腺苷+去甲腎上腺素組和G腺苷+緩激肽+去甲腎上腺素組較A缺血再灌注組和B缺血預(yù)處理組LVSP偏高（P＜0.05

10、），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 LVEDP在缺血10min—30min時(shí)明顯上升，在復(fù)灌30min—60min達(dá)到高峰后緩慢下降或保持水平，但遠(yuǎn)高于給藥前水平。各組在給藥前和缺血前LVEDP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；缺血10min—30min各組LVEDP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；再灌注30min—60min各組LVEDP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；再灌注120min F1腺苷+去甲腎上腺素組、F2腺苷+緩激肽組和G腺苷+緩激肽

11、+去甲腎上腺素組較A缺血再灌注組和B缺血預(yù)處理組LVEDP偏低（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?！纃p/dt max在缺血10min—30min時(shí)明顯上升，然后顯著下降。各組在給藥前和缺血前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；缺血10min—30min，F(xiàn)1腺苷+去甲腎上腺素組和G腺苷+緩激肽+去甲腎上腺素組較A缺血再灌注組和B缺血預(yù)處理組±dp/dt max偏高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；再灌注30min—60min各組+dp/dt m

12、ax無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；再灌注120min所有組均較A缺血再灌注組±dp/dt max偏高（P<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)1腺苷+去甲腎上腺素組和G腺苷+緩激肽+去甲腎上腺素組較B缺血預(yù)處理組±dp/dt max偏高（P<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 全組除D去甲腎上腺素組6只動(dòng)物有5只實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)心室纖顫在實(shí)驗(yàn)中死亡，余動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前存活。 2、血清酶學(xué)指標(biāo) 缺血預(yù)處理組及聯(lián)合藥物預(yù)處理組SOD值均高

13、于空白對(duì)照組（P<0.05），cTnT、MDA值均低于空白對(duì)照組（P<0.05）；藥物預(yù)處理組cTnT值均低于缺血預(yù)處理組，SOD值均高于缺血預(yù)處理組（P<0.05）。腺苷聯(lián)合其他藥物F1、F2、G組的cTnT、MDA值含量較C腺營(yíng)組含量低（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D去甲腎上腺素組造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大量死亡，F(xiàn)1、G組的cTnT、MDA含量較D組含量低，SOD值均高于D組。聯(lián)合藥物G組cTnT、MDA含量較E緩激肽組含量低（P<0.

14、05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第二部分： 心肌組織PKC含量比較可見(jiàn)缺血預(yù)處理組及聯(lián)合藥物預(yù)處理組均高于空白對(duì)照組（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、E組的PKC值均高于B組（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Western—blotting檢測(cè)見(jiàn)缺血預(yù)處理組及聯(lián)合藥物預(yù)處理組MMK4、JNK3、C—jun、NF—κB低于空白對(duì)照組（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩在組間比較中，聯(lián)合腺苷+緩激肽+去甲腎

15、上腺素3種藥物組，MMK4、JNK3、C—jun、NF—κB較低。RT—PCR法觀察MKK4、JNK3、c—Jun、NF—κB mRNA的含量變化也有同樣表現(xiàn)。 光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后即出現(xiàn)心肌損傷性病變，表現(xiàn)為心肌橫紋模糊，細(xì)胞腫脹和間質(zhì)水腫，見(jiàn)點(diǎn)片狀溶解灶。藥物預(yù)處理及缺血預(yù)處理后，病變有所轉(zhuǎn)歸，主要表現(xiàn)為部分細(xì)胞腫脹和橫紋模糊。 結(jié)論： 1.腺苷、緩激肽、去甲腎上腺素聯(lián)合藥物預(yù)處理可以模擬缺血預(yù)處理的心