間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基通過NLRP3炎癥小體增加胰島素敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、目的:①探討分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法并鑒定其相關(guān)表型，收集培養(yǎng)的上清液并將其制備成濃縮條件培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?。②證實(shí)NLRP3炎癥小體及其下游分子在游離脂肪酸(FFA)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗過程中的表達(dá)情況。③初步明確PA和LPS能夠通過慢性炎癥過程誘導(dǎo)胰島素抵抗，進(jìn)一步探討B(tài)MSCs-CM通過作用于NLRP3、IL-1β、IL-18及TNF-α所致炎癥反應(yīng)而提高HepG2細(xì)胞胰島素敏感性的可能機(jī)制。
　

2、　方法:首先，常規(guī)無(wú)菌條件下分離、培養(yǎng)并鑒定BMSCs，通過貼壁培養(yǎng)法對(duì)其進(jìn)行純化，傳代并收集第2-4代細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，進(jìn)一步將其進(jìn)行濃縮處理。進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)分為5組:以正常HepG2細(xì)胞作為空白對(duì)照，分別以BSA、PA、LPS及PA+LPS作為造模組，根據(jù)各組內(nèi)葡萄糖利用情況篩選出最佳造模劑使用濃度及作用時(shí)間，同時(shí)測(cè)定造模組內(nèi)炎癥因子的表達(dá)量。最后，在慢性炎癥誘導(dǎo)胰島素抵抗成功的基礎(chǔ)上加入BMSCs-CM，同時(shí)以加入同樣經(jīng)半透膜濃縮后

3、的無(wú)血清L-DMEM作為陰性對(duì)照，分別采用葡萄糖及糖原檢測(cè)試劑盒來(lái)分析各組葡萄糖利用情況;ELISA觀察各組炎癥因子的表達(dá)量;采用qRT-PCR方法來(lái)分析細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá);Western blot檢測(cè)BMSCs-CM對(duì)胰島素發(fā)揮作用的靶蛋白基因的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)BMSCs并對(duì)收集的上清液進(jìn)行了濃縮條件培養(yǎng)基的配制;構(gòu)建了慢性炎癥誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型，造模組胞內(nèi)糖原含量明顯減低而培養(yǎng)基中葡糖糖的含量

4、則較空白組顯著增多;而在加入BMSCs-CM后上述葡萄糖代謝水平均得到了提高，ELISA及qRT-PCR法分別從蛋白質(zhì)的分泌和基因表達(dá)兩個(gè)水平說明間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠發(fā)揮抗炎作用，Western blot結(jié)果提示，與胰島素抵抗組相比，BMSCs-CM組HepG2細(xì)胞內(nèi)的胰島素作用蛋白表達(dá)得到了恢復(fù)。
　　結(jié)論:本研究表明BMSCs-CM可以通過調(diào)控NLRP3炎癥小體及其下游相關(guān)炎癥因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮增加葡萄糖攝取及利用的作用，