芷辛方治療癌痛及TLr-NF-kappa B信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、癌痛是臨床晚期癌癥患者最常見的癥狀之一，一半以上的癌癥患者會(huì)經(jīng)歷劇烈且很難控制的疼痛，雖然嗎啡等阿片類藥物對(duì)癌痛的療效顯著，但是，伴隨成癮性、胃腸道反應(yīng)等副作用。因此，緩解疼痛是臨床醫(yī)生面臨的最大的難題。癌痛是一個(gè)復(fù)雜的病理學(xué)過程，同時(shí)也是臨床上的一大難題。癌痛屬于慢性疼痛的范疇，與炎癥痛和神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制相比，有相似之處，也有其獨(dú)特而復(fù)雜之處。所以建立合適的動(dòng)物模型對(duì)于深入的研究癌痛機(jī)制就顯得非常重要。自1999年Schwei首次報(bào)

2、道了小鼠骨癌痛模型以來(lái)，其它癌痛動(dòng)物模型也相繼產(chǎn)生，這將對(duì)癌痛機(jī)制的深入探討、尋找緩解癌痛新方法、篩選有效的鎮(zhèn)痛藥物提供極為有效的途徑。為了給臨床上癌痛的治療提供更可靠、有效的方法，研究者通過構(gòu)建適當(dāng)?shù)墓前┩磩?dòng)物模型進(jìn)行對(duì)癌痛的機(jī)制和治療的基礎(chǔ)研究。
　　中藥鎮(zhèn)痛是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的偉大智慧結(jié)晶，因作用廣、毒副作用小并而且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便而普遍被患者接受。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，中藥對(duì)急性或者慢性疼痛都能起到一定的鎮(zhèn)痛作用。臨床實(shí)踐表明，中藥用于癌痛

3、病人，不僅能夠鎮(zhèn)痛，還能通過調(diào)節(jié)癌癥患者的免疫功能，從而達(dá)到提高癌癥患者生活質(zhì)量的治療目的。但是長(zhǎng)期以來(lái)，由于缺乏合適的癌痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，阻礙了對(duì)癌痛機(jī)理的研究，同時(shí)也影響了新型有效的癌痛治療方法的研究，包括一些癌痛新藥及針刺等非藥物治療的方法。
　　相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與慢性疼痛密切相關(guān)。膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞）在主要的痛覺傳遞物質(zhì)中起著重要的作用。此外，膠質(zhì)細(xì)胞釋放出的致炎細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-

4、1β、IL-6等）都是引起痛覺傳遞神經(jīng)元敏化的主要因素，促進(jìn)中樞敏化的形成。由此可見，膠質(zhì)細(xì)胞在痛覺的初級(jí)傳入和發(fā)展過程中至關(guān)重要，以及在痛覺調(diào)節(jié)特別是疼痛中樞敏化的形成與維持中舉足輕重。
　　芷辛方是河南省中醫(yī)藥研究院著名研究員張海岑50多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，芷辛方由白芷、細(xì)辛、川芎等藥物組成，具有溫經(jīng)通絡(luò)、活血化痹、祛風(fēng)止痛的功效。經(jīng)臨床研究證實(shí)，芷辛方用于治療包括骨癌痛在內(nèi)的多種痛癥，效果顯著。綜上所示，本論文開展以下研究:

5、r>　　1.參照以往文獻(xiàn)報(bào)道建立癌痛動(dòng)物模型以尋找有效緩解疼痛的方法，并進(jìn)一步探討芷辛方的鎮(zhèn)痛作用。通過對(duì)模型大鼠體重、脛骨病理、脛骨X光片、后肢熱痛覺過敏、機(jī)械性痛覺超敏（觸誘發(fā)痛）以及自發(fā)性疼痛的研究對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)估。
　　2.觀察癌痛時(shí)大鼠脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞以及相關(guān)機(jī)制作用下指標(biāo)的變化。
　　1)用免疫組化對(duì)各組大鼠脛骨癌痛時(shí)脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP(GlialFibrillary Acidic Protein，

6、膠質(zhì)纖維酸性蛋白)進(jìn)行檢測(cè);
　　2)用Western Blot對(duì)各組大鼠脛骨癌痛時(shí)脊髓NF-KB(Nuclear factor-kappa B，核因子κB)和SIGIRR進(jìn)行檢測(cè);
　　3)用RT-PCR對(duì)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白CD11b和Toll受體2(TLR2)及4(TLR4)進(jìn)行檢測(cè);
　　4)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)各組大鼠脛骨癌痛時(shí)致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果

7、如下:
　　1.骨癌痛模型的建立
　　通過對(duì)大鼠左脛骨內(nèi)接種含有3×103個(gè)Walker256嫁接的腹水瘤細(xì)胞液造模，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，骨癌痛模型組與空白組體重顯示非常顯著性差異，且骨癌痛模型組的體重增加遲緩甚至呈下降趨勢(shì)（P＜0.01）。骨癌痛模型組比空白組動(dòng)痛大鼠自發(fā)性運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)出非常顯著性差異，且明顯呈上升趨勢(shì)（P＜0.01）。和空白組相比較，機(jī)械痛覺超敏骨癌痛模型組與空白組相比呈現(xiàn)出非常顯著性差異，且明顯的下降趨勢(shì)（P＜0

8、.01）。和空白組相比較，大鼠模型組手術(shù)側(cè)脛骨的X線影像以及HE染色顯示骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變和破壞。
　　2.大鼠脛骨癌痛時(shí)脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞功能活動(dòng)變化
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、骨癌痛模型組、西藥對(duì)照組（鹽酸曲馬多，10μ g·kg-1）、中藥對(duì)照組（五靈止痛膠囊，60μ g·kg-1）、高劑量芷辛方治療組、正常劑量芷辛方治療組、低劑量芷辛方治療組（芷辛方高、中、低水煎濃縮制劑分別為9 g·kg-1、4.5 g·kg-1、2.

9、25g· kg-1生藥/只），并于造模14 d后開始灌胃，每日一次，連續(xù)7d。第21 d，取各組大鼠血清、手術(shù)側(cè)脛骨及其脊髓腰膨大段(L4～L6)，并對(duì)其組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)、WesternBlot、RT-PCR等形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)。
　　1)免疫組化檢測(cè)骨癌痛模型組的髓內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白GFAP，呈現(xiàn)明顯升高，且明顯多于空白組、芷辛正常劑量組和芷辛高劑量組。骨癌痛發(fā)生時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大，芷辛方對(duì)其具有抑制鎮(zhèn)痛

10、作用。
　　2) PCR檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白CD11b，骨癌痛模型組的CD11b mRNA明顯高于芷辛正常劑量和芷辛高劑量（P＜0.01)。表明骨癌痛時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為增殖活化，芷辛方對(duì)其有抑制鎮(zhèn)痛的作用。
　　3)芷辛方干預(yù)治療的骨癌痛組的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫活性重要因子TLR2、TLR4 mRNA與骨癌痛模型組出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。骨癌痛模型組的NF-κB/GAPDH的蛋白水平與正常組和芷辛高劑量組的表達(dá)出現(xiàn)

11、顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果顯示，中樞疼痛TLR-NF-κB信息通路被激活，芷辛方通過對(duì)TLR的抑制從而達(dá)到對(duì)其下游通路的抑制和治療作用，進(jìn)而達(dá)到止痛的效果。
　　4)骨癌痛模型組髓內(nèi)的SIGIRR(Single Ig IL-1-related receptor，單一免疫球蛋白白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白)蛋白表達(dá)與芷辛高劑量組、芷辛正常劑量組的表達(dá)出現(xiàn)非常顯著性差異(P＜0.01)，這與NF-κB的結(jié)果相反。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芷辛高劑量

12、組的表達(dá)高于空白組，而芷辛正常劑量組的表達(dá)與西藥組接近。提示著芷辛方通過對(duì)SIGIRR的活化從而達(dá)到對(duì)NF-κ B的抑制作用，這可能是芷辛方降低和治療癌痛的機(jī)制之一。
　　5)大鼠脛骨癌痛時(shí)致炎因子TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α，腫瘤壞死因子-α)、IL-1β(Interleukin-1 beta，白細(xì)胞介素-1beta)、IL-6(Interleukin-6，白細(xì)胞介素-6)的表達(dá)變化
　　芷辛

13、方高劑量治療組、空白組的IL-1β表達(dá)低于骨癌痛模型組，存在非常顯著性差異(P＜0.01)，而芷辛方正常劑量治療組的IL-1β表達(dá)與骨癌痛模型組，存在明顯的差異(P＜0.05)。不僅如此，芷辛方高劑量治療組、空白組的IL-6、TNF-α表達(dá)低于骨癌痛模型組，存在非常顯著性差異（P＜0.01）;芷辛方正常劑量治療組的的IL-6與骨癌痛模型組存在明顯的差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:骨癌痛發(fā)生時(shí)，脊髓水平膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化與TLR-