東北地區(qū)百合屬植物種類鑒定及親緣關(guān)系的RAPD分析.pdf

1、本實驗對從東北地區(qū)收集到的15份百合屬植物資源進(jìn)行種類鑒定，經(jīng)鑒定為9個種。應(yīng)用正交設(shè)計和單因素試驗相結(jié)合的方法對RAPD反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行了優(yōu)化，建立了穩(wěn)定高效的擴(kuò)增體系，用RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果對其親緣關(guān)系進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確了東北地區(qū)百合屬植物的親緣關(guān)系和分類。主要結(jié)論如下： 從東北地區(qū)收集到15份百合資源，對其莖、葉、花序、花等分類學(xué)性狀進(jìn)行調(diào)查和種類鑒定，將15份試材鑒定為9個種，其中細(xì)葉百合2份、有斑百合2份、大

2、花百合1份、毛百合2份、朝鮮百合2份、大花卷丹2份、卷丹2份、垂花百合1份、東北百合1份。 建立了穩(wěn)定的適用于百合的RAPD-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。選擇模板濃度、Mg2’濃度、dNTP濃度、引物濃度和Taq DNA聚合酶濃度5種因素，每種因素選定4個水平，進(jìn)行正交設(shè)計L<,16>(4<'5>)，優(yōu)化反應(yīng)體系；再對以上5種因素設(shè)置不同的濃度梯度，進(jìn)行單因素逐項優(yōu)化。得到的最佳RAPD-PCR反應(yīng)體系為：10xBuffer2μl

3、、模板DNA2.0μl(40ng/μl)、Mg<'2+>2.0μl(25mmol/L)、dNTP1.2μl(10mmol/L)、引物2.0μl(20ng/μl)、Taq DNA聚合酶0.2μl(5U/μl)、H<,2>O 11.6μl。選擇退火時間、延伸時間和循環(huán)次數(shù)3種因素，每種因素選定4個水平，進(jìn)行正交設(shè)計L<,16>(4<'3>)，優(yōu)化反應(yīng)程序；再對以上3種因素和退火溫度設(shè)置不同的梯度，進(jìn)行單因素逐項優(yōu)化。得到的最佳RAPD-PC

4、R反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec、39℃退火40sec、72℃延伸1 min，45個循環(huán)；72℃延伸10min。 應(yīng)用RAPD最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)|北地區(qū)百合屬植物9個種共15份資源進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并進(jìn)行了親緣關(guān)系聚類分析。從144個10堿基隨機(jī)引物中篩選出帶型理想的15個引物用于RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出256條帶，多態(tài)性達(dá)87.5％。利用DPS軟件對RAPD圖譜記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得出歐氏距離矩陣及聚

5、類分析樹狀圖，不同種百合的親緣關(guān)系可由樹狀圖及歐氏距離顯示出來，東北地區(qū)9種百合屬植物可以被聚為三大類。首先不同產(chǎn)地的同種資源聚到一起；朝鮮百合與有斑百合、大花百合親緣關(guān)系最近，東北百合(輪葉組)與其他組百合親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，傳統(tǒng)形態(tài)分類系統(tǒng)中把葉序作為第一分類指標(biāo)是可行的。卷瓣組的細(xì)葉百合、垂花百合、朝鮮百合與鐘花組的有斑百合、大花百合聚為一類，卷瓣組的卷丹、大花卷丹與鐘花組的毛百合聚為一類，說明卷瓣組與鐘花組之間存在著基因交流。實驗結(jié)果