丙酮酸激酶M2亞型的表達(dá)上調(diào)對(duì)大腸癌細(xì)胞糖代謝和腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：檢測(cè)大腸癌組織中丙酮酸激酶M1/M2亞型(Pyruvate Kinase IsoenzymeM1/M2，PKM1/PKM2)的表達(dá)改變；分析PKM的表達(dá)改變與大腸癌病理類型以及臨床病理分期的關(guān)系；研究PKM2的表達(dá)對(duì)大腸癌糖代謝的影響；研究PKM2的表達(dá)對(duì)大腸癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：選擇2009年12月至2010年4月本組手術(shù)治療的大腸癌患者腫瘤組織60例為研究對(duì)象，取切緣正常腸粘膜為陰性對(duì)照，

2、應(yīng)用PKM1和PKM2特異性抗體，采用免疫印跡(Western blot，Wb)的方法檢測(cè)大腸癌組織中PKM1和PKM2蛋白水平的表達(dá)改變。并采用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IH)的方法檢測(cè)丙酮酸激酶亞型在大腸癌組織及正常大腸粘膜組織中的表達(dá)差異。設(shè)計(jì)并合成PKM2特異性引物，采用real-time PCR的方法對(duì)大腸癌中PKM2-mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，并結(jié)合臨床病理資料對(duì)PKM2-mRNA的水平與腫

3、瘤病理類型及臨床病理分期之間的關(guān)系進(jìn)行分析。進(jìn)一步應(yīng)用Western blot的方法驗(yàn)證大腸癌細(xì)胞株中PKM亞型的表達(dá)改變。并設(shè)計(jì)PKM2特異性shRNA及無基因干擾作用的陰性對(duì)照，包裝慢病毒，感染RKO細(xì)胞株并篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Clark氧電極檢測(cè)細(xì)胞氧耗率，液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖代謝率，吸光度法檢測(cè)細(xì)胞乳酸生成率。并分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)和Transwell法檢測(cè)細(xì)胞增殖和遷移能力。選用nu/nu裸鼠，檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的改變。

4、>　　 結(jié)果：大腸癌組織中：PKM1蛋白水平明顯低于正常大腸粘膜組織(0.77±0.21 vs0.91±0.28，P=0.010)，而其PKM2的蛋白水平則明顯高于后者(1.32±0.49 vs0.98±0.34，P=0.006)；正常大腸粘膜組織及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)PKM1，而大腸癌細(xì)胞主要表達(dá)PKM2；腫瘤組織中PKM2-mRNA的表達(dá)水平較正常大腸組織也明顯上升(△Ct：4.65±2.09 vs6.91±2.27，P=0.00

5、0)；統(tǒng)計(jì)分析顯示，PKM2-mRNA的表達(dá)與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多及臨床病理分期較晚的病人PKM2-mRNA的表達(dá)水平較高。包括大腸癌細(xì)胞株RKO、HCT116、SW480、HT29，轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞株HEK293和293T以及來源于胚胎組織的正常大腸粘膜細(xì)胞株CCD841等增殖性細(xì)胞株均選擇性表達(dá)PKM2。shRNA能夠有效下調(diào)RKO細(xì)胞株中PKM2的表達(dá)水平，對(duì)照序列對(duì)PKM2表達(dá)水平無明顯影響。下調(diào)

6、PKM2表達(dá)水平后RKO細(xì)胞葡萄糖酵解率(49.57 vs32.77，p<0.01)和乳酸生成率(8.71 vs3.49，p<0.01)均明顯降低，而氧耗率無明顯改變(3.36 vs3.70，p=0.266)。下調(diào)PKM2表達(dá)水平后細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移能力以及體內(nèi)成瘤能力均被明顯抑制。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(shPKM2)的五天倍增數(shù)(6.34 vs4.81，p<0.01)、穿過transwell膜的細(xì)胞數(shù)(136.3±8.5 vs85.3±8.

7、7，p<0.01)較對(duì)照細(xì)胞(con)明顯下降。接種shPKM2細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間晚于con細(xì)胞，且前者成瘤數(shù)量(8 vs10)和重量(3.0±0.4 vs1.3±0.2，p=0.002)均少于后者。
　　 結(jié)論：大腸癌組織中PKM2的表達(dá)水平明顯升高，其中腫瘤細(xì)胞主要表達(dá)PKM2而腫瘤間質(zhì)細(xì)胞則主要表達(dá)PKM1；PKM2表達(dá)水平的升高與腫瘤的臨床病理分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多及分期較晚病人的大腸腫瘤組織中PKM2的表達(dá)水平較高；