糞類圓線蟲RIO3蛋白激酶基因克隆、表達及分布特征的研究.pdf

1、蛋白激酶是一類重要的酶，調(diào)控大量的細胞過程包括細胞周期的前進、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及代謝。根據(jù)其結(jié)構(gòu)分類，蛋白激酶分為典型蛋白激酶和非典型蛋白激酶。RIO激酶家族屬于非典型蛋白激酶。該家族有三個成員RIO1、RIO2和RIO3，是近年來發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白家族。RIO1、RIO2激酶存在于從古細菌到人類的組織中，且具有組織特異性，這表明RIO激酶在細胞中具有最基本的作用。對酵母RIO1、RIO2蛋白激酶的研究表明：RIO1、RIO2激酶

2、在核糖體生物學(xué)中有重要作用，是細胞進入S2細胞周期及完成有絲分裂的必要因素。人類腫瘤組織中RIO1mRNA與鄰近的正常組織相比，過量表達，且呈現(xiàn)出不同的組織分布。人類RIO2是40S核糖體亞基前體成熟的必需因子，也是polo樣蛋白激酶的受體蛋白，介導(dǎo)細胞有絲分裂。人類RIO3蛋白僅存在于多細胞生物的細胞質(zhì)中，不影響細胞周期，能夠抑制CASP10激活NFκB通路的活性。人類RIO3基因的上調(diào)，促進了胰腺癌細胞的增殖與擴散。
　　

3、在營自由生活的線蟲-秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的研究中，高通量RNAi篩選實驗表明：RIO1及RIO2的敲除影響幼蟲的發(fā)育，導(dǎo)致幼蟲停止發(fā)育、幼蟲死亡以及胚胎死亡，暗示了這個基因是控制線蟲發(fā)育的決定因素之一。盡管這個基因如此重要，到目前為止，在寄生性線蟲中，僅有透明毛圓線蟲RIO1及捻轉(zhuǎn)血矛線蟲RIO1、RIO2、RIO3的基因結(jié)構(gòu)報道，無任何其它寄生線蟲相關(guān)功能的報道。為此，本課題主要從以下幾個方面進

4、行了研究：
　　 1)糞類圓線蟲RIO3基因的cDNA、gDNA、啟動子序列分析
　　 通過RACE技術(shù)獲得糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)RIO3蛋白激酶的全長cDNA序列，全長1765bp，預(yù)測ORF序列長1521bp，編碼506個氨基酸，其中5’-UTR為179bp，3’-UTR為65bp。用生物信息學(xué)對Ss-RIO3-cDNA的序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)它與其它物種該基因氨基酸序列的同源

5、性在22.5%-37.4%之間，且含有RIO激酶的保守功能區(qū)域。用鄰接法構(gòu)建RIO3氨基酸進化樹，選擇了19個物種做參考，其中包括6個種類的線蟲，6種線蟲分支形成一簇，其中包括糞類圓線蟲。通過長PCR技術(shù)獲得了糞類圓線蟲RIO3的gDNA序列，經(jīng)與cDNA序列比對分析發(fā)現(xiàn)RIO3基因沒有內(nèi)含子。而其它兩個線蟲(捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、秀麗新桿線蟲)該基因均含有內(nèi)含子，說明糞類圓線蟲的該基因具有其特異性。通過Genome Walking技術(shù)獲得RI

6、O3基因的啟動子序列，長為600bp。啟動子元件分子表明：RIO3啟動子序列含有4個TATAbox(TATAWAW)，4個GATAmotif(WGATAR)，2個InverseGATA(TTATC)。
　　 2)RIO3基因在糞類圓線蟲各發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平
　　 通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)，研究各階段(寄生性成蟲pAD，寄生性一期幼蟲ppL1，自由生活的一期幼蟲pfL1，自由生活的三期幼蟲iL3，自由生活的成蟲

7、FAD)蟲體該基因的轉(zhuǎn)錄水平。研究結(jié)果表明：該基因在各發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄，其中感染期三期幼蟲和自由生活的成蟲轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　 3)體外原核表達糞類圓線蟲RIO3激酶蛋白并檢測其激酶活性
　　 構(gòu)建原核表達載體，體外微量表達了該蛋白。截取RIO3cDNA序列從499bp到1419bp的片段，體外原核表達了該截短序列。進一步酶活檢測實驗發(fā)現(xiàn)該表達截短蛋白不能自磷酸化及磷酸化MBP蛋白，說明該截短蛋白不具有自磷酸化活性及磷酸

8、化MBP蛋白的功能，有待進一步研究。
　　 4)糞類圓線蟲RIO3基因啟動子在蟲體中的定位研究
　　 構(gòu)建綠熒光表達載體Ss-promoter-PAJ02，通過性腺顯微注射技術(shù)導(dǎo)入自由生活的雌蟲性腺中，觀察自由生活的雌蟲、蟲卵、L1期幼蟲中該基因在蟲體中的空間表達形式，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該基因在蟲體中表達。
　　 本研究獲得了Ss-RIO3蛋白激酶的cDNA，gDNA及啟動子的DNA序列并對其結(jié)構(gòu)特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)該基