心包固定術(shù)聯(lián)合血管生長素在心肌血?jiǎng)游锬Ｐ椭谐醪綉?yīng)用研究.pdf

1、缺血性疾病一直是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，嚴(yán)重的威脅著人類的健康?，F(xiàn)有的藥物治療僅能部分緩解心肌供血的供需矛盾，并不能從根本上解決心肌缺血的問題，而CABG、PTCA及冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架放置術(shù)等機(jī)械性心肌再血管化治療，雖然在大多數(shù)患者中產(chǎn)生了良好的療效，但也存在著遠(yuǎn)期血管再狹窄等危險(xiǎn)。更重要的是，這些再血管化的治療方法，無法應(yīng)用于彌漫性冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端分支狹窄及CABG術(shù)后旁路血管再狹窄的患者，而這類患者的數(shù)量十分龐大。人們一直在尋求新的治療方法。

2、
　　 近年來，隨著血管生長因子的研究進(jìn)展為這一問題的解決帶來了希望。國內(nèi)外在大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用血管生長因子基因治療技術(shù)，在誘導(dǎo)心肌新生血管的形成，提高側(cè)枝循環(huán)的代償能力，實(shí)現(xiàn)心肌內(nèi)源性再血管化方面已取得一定的效果，但這些手段都不能從根本上解決心肌缺血的問題。因?yàn)樾募」Ｋ篮?，僅僅依靠心肌自身新生血管來適應(yīng)缺血變化的過程非常緩慢，而且一般情況下，也只能部分代償，難以緩解心功能的損害以及癥狀的加重。近年來，我們在對患者進(jìn)行二

3、次心臟手術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)心包與心臟產(chǎn)生廣泛粘連的同時(shí)心包動(dòng)脈網(wǎng)血管增生進(jìn)入心肌。由此我們考慮是否可利用增生的心包動(dòng)脈網(wǎng)為缺血心肌提供充分的血液供應(yīng)。1955年P(guān)lachtaA等人做過類似研究，他們首次采用復(fù)合硅酸鎂(滑石粉)注入心包腔，使心包和心臟在慢性無菌性炎癥的刺激下發(fā)生粘連(即心包固定術(shù))，使心包動(dòng)脈網(wǎng)增生進(jìn)入心肌為缺血心肌提供血液供應(yīng)，雖然可觀察到一定量新生血管的產(chǎn)生，但明顯增厚的心包與心臟的廣泛粘連嚴(yán)重限制了心臟的舒張與收縮功能。

4、r>　　 因此，我們設(shè)想找到一種方法將心包增厚程度控制在一定范圍內(nèi)并與梗死灶周圍產(chǎn)生局部粘連，同時(shí)給予血管生長素重組腺病毒促進(jìn)心包動(dòng)脈網(wǎng)增生進(jìn)入心肌組織并與心肌內(nèi)部血管形成廣泛的側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到挽救冬眠心肌和頓抑心肌，阻止進(jìn)行性的心肌細(xì)胞死亡、非梗死區(qū)心肌肥大和纖維化，減輕心室重構(gòu)，預(yù)防心功能不全的目的。
　　 心包動(dòng)脈網(wǎng)的動(dòng)脈來源有胸廓內(nèi)動(dòng)脈、胸腺動(dòng)脈、甲狀腺下動(dòng)脈、甲狀頸干、支氣管動(dòng)脈、隔上動(dòng)脈以及隔下動(dòng)脈，血供十分豐富

5、。此外，血管生長素(ANG)重組腺病毒制備技術(shù)成熟，本實(shí)驗(yàn)室也已證明其較強(qiáng)的促血管化作用；以及新的促炎癥反應(yīng)試劑(弗氏不完全佐劑)的應(yīng)用。這些都為我們實(shí)驗(yàn)的可行性奠定了基礎(chǔ)。本課題主要研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下：
　　 1.高滴度血管生長素(ANG)基因重組腺病毒的制備與鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)所采用的Ad.ANG是本研究所采用腺病毒DNA末端肽復(fù)合物和重組粘粒共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的方法所制備的單克隆ANG重組腺病毒。
　　

6、 取本實(shí)驗(yàn)室己制備好的單克隆Ad.ANG液解凍后感染293細(xì)胞，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行反復(fù)凍融離心后得到新一代重組腺病毒液。經(jīng)用PEG/NaCl沉淀法純化，得到Ad.ANG滴度為3.2×1010pfu/ml。
　　 2.血管生長素(ANG)重組腺病毒的體外轉(zhuǎn)錄
　　 MOI值為100時(shí)進(jìn)行Ad.ANG在體外轉(zhuǎn)染ECV304，RT-PCR檢測表明轉(zhuǎn)染后第1、3、7天，均可測出ANG的mRNA轉(zhuǎn)錄，其反應(yīng)產(chǎn)物電泳后可見長度為

7、184bp的特異性條帶，而對照組均未見ANG基因的轉(zhuǎn)錄，由此說明ANG重組腺病毒已成功進(jìn)入ECV304細(xì)胞，并可轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。Westernblot檢測結(jié)果提示ANG蛋白可高效表達(dá)。
　　 3.動(dòng)物模型的建立及分組
　　 取75只健康雄性新西蘭大白兔75只隨機(jī)分為5組：
　　 第1組：心梗+心包粘連+Ad.ANG組；
　　 第2組：心梗+心包粘連+Ad.Null組；
　　 第3組：心梗+心

8、包粘連組；
　　 第4組：心梗+Ad.Null組；
　　 第5組：心梗+Ad.ANG組
　　 用枸櫞酸芬太尼0.025mg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉家兔后，于回旋支主干第1、2鈍緣支之間結(jié)扎后ECG檢查見Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背狀抬高，上抬大于2mm，即認(rèn)為心梗模型成功建立。5-0聚丙烯線關(guān)閉心包腔，用1ml的5EM-BT注射器緊貼心包腔膈面穿刺進(jìn)入心包腔，注射200μl的弗氏不完全佐劑建立心包粘連模型。病理檢查等結(jié)果證實(shí)

9、此模型穩(wěn)定、可靠，可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
　　 4.心包固定術(shù)聯(lián)合Ad.ANG對缺血心肌的再血管化作用
　　 通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ANG重組腺病毒的心肌組織中3天后即可檢測出184bp的ANG轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，第28天仍有少量表達(dá)，而未注射Ad.ANG組結(jié)果為陰性，表明本研究中構(gòu)建的重組腺病毒能夠應(yīng)用心包腔內(nèi)注射的方法將外源基因轉(zhuǎn)染心肌并在心肌肉表達(dá)，其表達(dá)時(shí)間至少可達(dá)4周，這對血管新生所需時(shí)間已足夠。
　　 病理觀察

10、顯示心肌梗塞發(fā)生后各組的毛細(xì)血管密度均隨時(shí)間延長而增加，而第1組增加幅度明顯高于其他四個(gè)對照組，尤以2周后變化更為突出。4周后第1組心包厚度與2周時(shí)相當(dāng)，但毛細(xì)血管密度明顯高于2周時(shí)；與其他4組相比，毛細(xì)血管密度明顯增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。
　　 心臟彩超檢查可見心肌梗塞發(fā)生后各組的心功能均明顯低下，隨時(shí)間延長均有所改善，至2周后第1組和第5組改善幅度明顯高于其他三組，各組4周后心功能的改善幅度均進(jìn)一步提高，第1、5組的EF值明顯

11、高于第2-3組；但第1組與第5組之間EF值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果提示可能是因?yàn)樾陌脑龊窦罢尺B在一定程度上限制了心臟的舒張和收縮。但第1組為缺血心肌提供了較其它4組更為豐富的血液供應(yīng)，阻止了進(jìn)行性的心肌細(xì)胞死亡。證明了此方法對增加心肌局部血供、拯救頓抑心肌、減輕心室重構(gòu)和改善心功能的有效性，整體上達(dá)到了提高心功能的目的。為治療缺血性心臟病積累了新的實(shí)驗(yàn)資料。綜合上述研究結(jié)果，我們的結(jié)論是：
　　 1.本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)所

12、制備的編碼人ANG的cDNA基因片段大，可用來設(shè)計(jì)引物的區(qū)域較少，特異性較差。因此，我們在引物設(shè)計(jì)、反轉(zhuǎn)錄及PCR條件優(yōu)化方面作了一些有益摸索，為今后類似工作的開展積累了一定的經(jīng)驗(yàn)。
　　 2.本課題中應(yīng)用的Cosmid-TPC磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的方法，目的基因重組腺病毒獲得率高、假陽性率低，同時(shí)我們對如何判斷重組腺病毒產(chǎn)生，如何獲取純化的高滴度的重組腺病毒建立了一套切實(shí)可行的方法，為快速、高效地得到重組腺病毒提供了一條

13、便捷途徑。
　　 3.本課題在兔心肌梗塞、心包粘連模型中應(yīng)用Ad.ANG心包腔內(nèi)注射的方式在心肌組織內(nèi)發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)染、表達(dá)并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。證明了ANG基因在機(jī)體內(nèi)可促進(jìn)缺血心肌內(nèi)新生血管形成。
　　 4.本實(shí)驗(yàn)在建立缺血性心肌的心包粘連模型過程中，通過總結(jié)前人的經(jīng)驗(yàn)與自己的探索，找到了一個(gè)確實(shí)可行的方法。成功建立了動(dòng)物模型，并證明了其在改善心肌血供和維護(hù)心功能方面優(yōu)于對照組，初步證明了此實(shí)驗(yàn)方法對改善心肌血供，阻止進(jìn)行