基底硬度與炎癥因子TGF-β1對氣道成纖維細胞生物學(xué)與力學(xué)行為影響的研究.pdf

1、哮喘是一種嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病。在哮喘中不僅存在氣道炎癥，并且還存在氣道組織的重塑（airway remoldeling）。在氣道重塑中，氣道壁增厚，上皮下纖維化，成肌纖維細胞（myofibroblasts，MF）和平滑肌細胞﹙airway Smooth muscle cell，ASMC﹚過度增生。氣道成纖維細胞不僅是氣道的結(jié)構(gòu)細胞，其在氣道組織中的增值、遷移與分化等行為與氣道重塑的發(fā)展過程密切相關(guān)。已有研究表明，在轉(zhuǎn)化生長因子-β1（t

2、ransforming growth factor-β1，TGF-β1）的誘導(dǎo)下，氣道成纖維細胞可以向成肌纖維細胞分化。成肌纖維細胞的超微結(jié)構(gòu)介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間，并且也表達平滑肌細胞的特征性蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），有人推測成肌纖維細胞是成纖維細胞向平滑肌細胞轉(zhuǎn)分化的過度形態(tài)。此外，在氣道重塑中，由于成肌纖維細胞過度合成和分泌細胞外基質(zhì)（excellular matri

3、x，ECM）蛋白，從而導(dǎo)致細胞外基底膜增厚和基底硬度增加。然而，細胞外基底硬度的增加能否影響氣道成纖維細胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為，能否影響炎癥因子TGF-β1誘導(dǎo)下的氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞的分化以及分化細胞的力學(xué)行為，從而加重哮喘的發(fā)病，至今并未被研究過。
　　為了研究這個問題，本課題以SD（Sprague Dawley）大鼠氣道成纖維細胞作為實驗載體。首先，人工合成不同硬度的PDMS（Polydimethylsiloxa

4、ne，PDMS）基底，楊氏模量分別1kPa、10 kPa、50 kPa；其次，原代培養(yǎng)和鑒定大鼠氣道成纖維細胞。然后，將大鼠氣道成纖維細胞接種在不同硬度的基底上，測量基底硬度對氣道成纖維細胞形態(tài)、黏著斑、增殖和遷移等生物學(xué)行為的影響。最后，將大鼠氣道成纖維細胞接種在不同硬度的基底上，并用10 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)其向成肌纖維細胞分化。測量基底硬度對TGF-β1誘導(dǎo)的氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞分化的影響以及分化細胞力學(xué)行為的影響

5、。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　①基底硬度對氣道成纖維細胞形態(tài)、黏著斑、增殖與遷移等生物學(xué)行為的影響：用相差顯微鏡觀察并記錄基底硬度對氣道成纖維細胞粘附形態(tài)的影響；免疫熒光法檢測基底硬度對氣道成纖維細胞黏著斑（vinculin）的影響；細胞計數(shù)法測量不同硬度基底上氣道成纖維細胞的生長曲線；MTT法檢測基底硬度對氣道成纖維細胞增殖活力的影響；劃痕法檢測基底硬度對氣道成纖維細胞遷移的影響。研究發(fā)現(xiàn)，基底硬度對氣道成纖維細胞的生物

6、學(xué)行為有重要影響。首先，不同硬度基底上的氣道成纖維細胞的粘附形態(tài)明顯不同?；子捕仍礁?，氣道成纖維細胞的鋪展面積越大、細胞長短徑比值越高；其次，免疫熒光檢測結(jié)果顯示，基底硬度對氣道成纖維細胞黏著斑（vinculin）的形成有影響作用，基底硬度越高，黏著斑（vinculin）的大小越大；然后，不同硬度基底上的氣道成纖維細胞的生長曲線顯示，在細胞未長至融合狀態(tài)時，基底硬度越高，氣道成纖維細胞的生長速度越快；另外，MTT試驗的結(jié)果表明，將氣道

7、成纖維細胞接種于不同硬度基底上24 h、48 h和72 h后，細胞的OD值均有極顯著性差異（P<0.01），基底硬度越高，氣道成纖維細胞的增殖活力越高；最后，劃痕法測量細胞遷移的結(jié)果表明，將不同硬度基底上的成纖維細胞劃痕處理12 h、24 h后，細胞的遷移率也具有極顯著性差異（P<0.01），細胞外基底硬度越高，氣道成纖維細胞的遷移能力越強。
　?、诨子捕葘GF-β1誘導(dǎo)的氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞分化的影響：用PR-PCR

8、法測量基底硬度對分化的細胞中α-SMA和I型膠原（collagen I）mRNA表達的影響；酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測基底硬度對分化過程中細胞分泌到胞外基質(zhì)中 collagen I蛋白表達的影響；Western blot檢測基底硬度對分化的細胞中α-SMA蛋白表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)，基底硬度能促進氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞的分化。首先，PR-PCR的結(jié)果表明，和

9、硬度為1 kPa基底上分化的細胞相比，硬度為10 kPa基底上分化的細胞的α-SMA和collagen I mRNA的表達量分別增加了0.14和0.32倍。而在硬度為50 kPa的基底上分化的細胞的α-SMA和collagen I mRNA的表達量分別增加了0.72（P<0.05）和0.64（P<0.05）倍；其次，ELISA的結(jié)果顯示，和硬度為1 kPa的基底上分化的細胞相比，硬度為10 kPa和50 kPa的基底上分化的細胞分泌到細

10、胞外基質(zhì)中的collagen I蛋白的表達量分別增加了0.03倍（P<0.05）和0.2倍（P<0.01）。說明，基底硬度越高，細胞在分化過程中分泌到細胞外基質(zhì)中的collagen I的蛋白量也越高；另外，Western blot檢測結(jié)果顯示，和硬度為1 kPa的基底上分化的細胞相比，硬度為10 kPa和50 kPa的基底上分化的細胞的α-SMA蛋白的表達量分別增加了0.43倍（P<0.05）和1.02倍（P<0.01）。這說明，基底硬

11、度越高，分化的細胞表達收縮蛋白α-SMA的量也越高。
　?、刍子捕葘?TGF-β1誘導(dǎo)的氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞細胞分化過程中細胞力學(xué)行為的影響：利用磁微粒扭轉(zhuǎn)細胞測量術(shù)（optical magnetic twisting cytometry，OMTC）測量基底硬度對分化的細胞的硬度和收縮反應(yīng)的影響。OMTC的測量結(jié)果顯示，所有分化的細胞都呈典型的冪率響應(yīng)行為：細胞的硬度（G’）隨著測量頻率（f）的升高而增大，并且兩者呈指數(shù)

12、關(guān)系，G’（f）~fα，α為擬合直線的斜率。而且，基底硬度越高，細胞的硬度也越大。冪率指數(shù)α，隨著硬度增加，從0.102增加到0.122；另外，測量結(jié)果顯示，基底硬度越高，分化的細胞的收縮反應(yīng)也越大。和硬度為1 kPa的基底上分化的細胞相比，硬度為50 kPa基底上分化的細胞的收縮反應(yīng)明顯增加（P<0.05）。
　　因此，在氣道重塑中，當(dāng)細胞外基底硬度增加，首先影響氣道成纖維細胞的形態(tài)、黏著斑、增殖與遷移?；子捕仍礁撸瑲獾莱衫w維

13、細胞的增殖與遷移速度越快，成纖維細胞增殖速度的增加使氣道上皮下纖維化進一步加重。而氣道成纖維細胞遷移速度的提高將可能導(dǎo)致氣道的其他病變。有人推測能引起氣道功能異常的氣道平滑肌細胞是由氣道成纖維細胞分化而來，氣道成纖維細胞可能通過遷移到平滑基層并分化為平滑肌細胞，因此成纖維細胞遷移速度的提高將可能影響哮喘的病變速度。其次，在氣道炎癥因子TGF-β1的誘導(dǎo)下，細胞外基底硬度的增加，能促進氣道成纖維細胞向成肌纖維細胞的分化以及影響分化細胞的力

14、學(xué)行為，導(dǎo)致分化的細胞的收縮蛋白α-SMA合成和表達增加、collagen I等細胞外基質(zhì)蛋白的合成和分泌增加、細胞硬度和細胞收縮反應(yīng)提高。細胞硬度和收縮反應(yīng)等力學(xué)行為的改變可能直接引起氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。而collagen I等細胞外基質(zhì)蛋白合成和分泌的升高，將導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的進一步沉積和硬度增加。這對哮喘的發(fā)生和發(fā)展是一個惡性循環(huán)的過程。
　　綜上所述，本文從生物學(xué)和生物力學(xué)的角度探討了細胞外基底硬度變化在氣道重塑發(fā)