結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中CD133分子表達(dá)的臨床意義及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中已上升至第三位，死亡率居惡性腫瘤死因的第二位。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年攀升，已成為危害人民健康的常見(jiàn)疾病之一。雖然近年來(lái)對(duì)結(jié)直腸癌的研究不斷深入，治療手段包括手術(shù)、化療、放療不斷改進(jìn)，但是復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移常導(dǎo)致治療失敗，最終導(dǎo)致患者死亡。
　　大量的研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞具有很大的異質(zhì)性。腫瘤組織內(nèi)只有很少量的細(xì)胞亞群具有形成新的腫瘤組織的能力，被稱(chēng)

2、之為腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSCs)或腫瘤起始細(xì)胞(Tumor Initiating Cells，TICs)。自1994年Lapidot，T成功從急性粒細(xì)胞白血病分離并鑒定出腫瘤干細(xì)胞以來(lái)，相繼在乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在。與普通腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因，如Nanog、SHH、NOTCH、HES、oct-4/3等。此外腫瘤

3、干細(xì)胞還表達(dá)某些標(biāo)記分子，其中CD133是最重要的標(biāo)記分子之一。
　　CD133分子是一種五次跨膜的糖蛋白，分子量約為120KD。起初研究發(fā)現(xiàn)CD133分子特異性表達(dá)在神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)表面。之后的研究發(fā)現(xiàn)CD133分子表達(dá)于多種胎兒或成體組織。雖然至今對(duì)CD133分子的功能還不明確，但是CD133單獨(dú)或與其他分子聯(lián)合已逐漸應(yīng)用于多種腫瘤干細(xì)胞的鑒定和生物學(xué)特性研究，如

4、腦膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、前列腺癌等。研究表明結(jié)直腸癌組織中CD133的表達(dá)顯著高于正常組織，并且CD133+細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)顯示了腫瘤形成能力。繼后大量的文獻(xiàn)報(bào)道了CD133與結(jié)直腸治療、預(yù)后的臨床研究。結(jié)果顯示，(1)CD133分子的表達(dá)與結(jié)直腸癌判斷患者生存期的獨(dú)立因素;(2) CD133分子的表達(dá)是腫瘤耐藥的重要標(biāo)記;(3) CD133的表達(dá)與腫瘤的臨床分期、病理分期以及患者的術(shù)后生存期等都具有相關(guān)

5、性。還有研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者術(shù)前經(jīng)非甾體類(lèi)抗炎藥治療，能降低腫瘤組織中CD133分子的表達(dá)，從而影響患者術(shù)后生存期。
　　CD133分子的表達(dá)有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，研究表明結(jié)直腸癌細(xì)胞異常甲基化可以導(dǎo)致CD133分子表達(dá)抑制;而進(jìn)展期腸癌細(xì)胞去甲基化則導(dǎo)致CD133分子表達(dá)異常增高;另外有研究發(fā)現(xiàn)CD133分子的表達(dá)受mTOR信號(hào)、低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor1-α，HIF-1α)信號(hào)通路的調(diào)

6、控;最近Kristel Kemper等研究結(jié)果顯示Ras-Raf調(diào)控通路突變可導(dǎo)致CD133分子表達(dá)異常增高。此外，UteBissels對(duì)造血干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，在造血干細(xì)分化過(guò)程中microRNA-142-3p對(duì)CD133分子的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，表明CD133表達(dá)分子還具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。
　　microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度大約為22bp的小分子RNA，是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分子。結(jié)直腸癌的演進(jìn)是一個(gè)緩慢演變的的過(guò)程。大多數(shù)結(jié)直腸癌經(jīng)歷了

7、正常腸組織、良性息肉、腺瘤、惡性腫瘤的演變過(guò)程。在這一過(guò)程中，伴隨多種microRNA表達(dá)的異常變化。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)microRNA對(duì)靶基因表達(dá)調(diào)控的異常，導(dǎo)致和/或促進(jìn)了結(jié)直腸的發(fā)生、發(fā)展。
　　綜上所述，在結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中CD133分子表達(dá)變化與腫瘤進(jìn)程的相關(guān)性，CD133分子表達(dá)變化的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。鑒此，本課題以結(jié)直腸癌這一常見(jiàn)的惡性腫瘤為研究對(duì)象，以腫瘤干細(xì)胞重要標(biāo)記分子CD133的表達(dá)為切入點(diǎn)，通過(guò)研究正常

8、腸組織、息肉/腺瘤、結(jié)直腸癌三種組織中CD133分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義，進(jìn)而探討結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中CD133分子表達(dá)異常變化的分子機(jī)制。課題旨在通過(guò)探討結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，為結(jié)直腸癌的研究及臨床治療提供新思路。
　　第一部分 CD133分子在結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及臨床意義
　　目的：研究CD133分子在正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，分析CD133分子在結(jié)直腸癌組織表達(dá)的臨床意

9、義。
　　方法：選取結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本及配對(duì)的遠(yuǎn)端正常腸組織石蠟包埋標(biāo)本各158例、良性息肉石蠟包埋標(biāo)本71例，免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)組織中CD133分子的表達(dá)。同時(shí)收集結(jié)直腸癌手術(shù)切除新鮮腫瘤標(biāo)本、遠(yuǎn)端組織標(biāo)本各8例、內(nèi)窺鏡下手術(shù)切除息肉標(biāo)本8例，消化酶消化后制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）檢測(cè)CD133分子表達(dá)率。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)直腸組織CD133分

10、子表達(dá)與患者臨床參數(shù)間相關(guān)性。Kaplane Meier生存曲線(xiàn)分析CD133分子表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：(1)免疫組化結(jié)果顯示正常腸組織、良性息肉、結(jié)直腸癌三種組織中CD133染色均顯示為典型的胞膜陽(yáng)性，各組的陽(yáng)性率分別為5.06％(8/158)、15.49％(11/71)、45.57％(72/158)。三組間CD133陽(yáng)性率具有顯著性差異(P＜0.001)。正常腸組織和息肉組織染色顯示，陽(yáng)性細(xì)胞為隱窩底部、排列

11、密集的細(xì)胞。而腸癌組織中細(xì)胞排列紊亂、失去固有組織結(jié)構(gòu)，CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例和程度顯著強(qiáng)于遠(yuǎn)端組織或良性病變組織;(2)流式細(xì)胞術(shù)分析三種組織細(xì)胞CD133分子的表達(dá)率分別為1.51±0.67％、3.48±1.66％、12.61±6.84％，組間具有顯著性差異(p=0.001)。結(jié)果顯示腸癌組織中CD133表達(dá)率顯著高于遠(yuǎn)端組織或息肉組織，與免疫組化結(jié)果一致;(3)結(jié)合結(jié)直腸癌患者臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，CD133的表達(dá)與腫瘤的病理分期

12、(p=0.033)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p＜0.001)、TNM分期(p=0.001)具有相關(guān)性。Kaplane Meier生存曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，CD133-患者中位生存期為71.0月，CD133+患者生存期為36.0月，CD133的表達(dá)與患者生存期具有相關(guān)性(p=0.001)。
　　結(jié)論：結(jié)直腸組織中CD133分子的表達(dá)在結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中呈上調(diào)表達(dá)，與結(jié)直腸癌的演變具有相關(guān)性;并且結(jié)直腸組織中CD133分子的表

13、達(dá)與腫瘤的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及患者的生存期相關(guān)。
　　第二部分結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中干細(xì)胞相關(guān)分子與CD133分子表達(dá)的相關(guān)性及意義
　　目的：分析結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程的不同階段，CD133分子的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞另一重要標(biāo)記分子CD44以及oct-4、klf-4、Sox2、Nanog和c-myc等干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性及意義。
　　方法：選取結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本及配對(duì)的遠(yuǎn)端正常腸組織石蠟包埋標(biāo)本各158例、

14、良性息肉石蠟包埋標(biāo)本71例，免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中CD44、oct-4、CD133分子的表達(dá)。同時(shí)收集結(jié)直腸癌手術(shù)切除新鮮腫瘤標(biāo)本、遠(yuǎn)端組織標(biāo)本各33例、內(nèi)窺鏡下手術(shù)切除息肉標(biāo)本33例，trizol抽提RNA，Real-time PCR研究oct-4、klf-4、Sox2、Nanog、 c-myc等干細(xì)胞相關(guān)基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄差異。收集結(jié)直腸癌手術(shù)切除新鮮腫瘤標(biāo)本、遠(yuǎn)端組織標(biāo)本各8例、內(nèi)窺鏡下手術(shù)切除息肉標(biāo)本8例，消化酶消化后制備單

15、細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組織細(xì)胞oct-4分子表達(dá)率。
　　結(jié)果：(1) CD44分子在組織細(xì)胞膜以及細(xì)胞外基質(zhì)均有表達(dá)。正常腸組織、息肉組織染色顯示，陽(yáng)性細(xì)胞為隱窩底部、排列密集的細(xì)胞;而腸癌組織中細(xì)胞排列紊亂、失去固有組織結(jié)構(gòu)，并且陽(yáng)性細(xì)胞比例和陽(yáng)性程度顯著強(qiáng)于遠(yuǎn)端或良性病變組織;CD44分子在結(jié)直腸癌演進(jìn)不同階段呈上調(diào)表達(dá)，與CD133分子表達(dá)變化一致;(2)在oct-4、klf-4、Sox2、Nanog、 c-myc等

16、干細(xì)胞相關(guān)基因中，oct-4在正常腸組織、息肉組織、腸癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平逐步升高;免疫組化結(jié)果顯示，oct-4分子表達(dá)于細(xì)胞核，呈細(xì)胞核染色陽(yáng)性。在正常結(jié)直腸、息肉組織、結(jié)直腸癌三種組織中oct-4分子表達(dá)逐步上調(diào)，并且與CD133分子的表達(dá)具有相關(guān)性。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析三種組織中oct-4表達(dá)，結(jié)果顯示，三種組織中oct-4的表達(dá)逐步增高，表達(dá)率分別為1.40±0.78％、2.91±1.57％、11.37±6.32％，組間具有顯著性差

17、異(p=0.001)，進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)的結(jié)果。結(jié)直腸癌組織標(biāo)本連續(xù)切片，分別研究CD133、oct-4分子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中存在CD133與oct-4分子的共表達(dá)。
　　結(jié)論：CD44分子在正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中表達(dá)逐步增高，與CD133分子的表達(dá)變化一致;結(jié)直腸癌演進(jìn)的不同階段干細(xì)胞相關(guān)基因oct-4表達(dá)逐步增高，并且與CD133分子表達(dá)相關(guān);由此提示，與良性組織相比，結(jié)直腸癌組織中不但

18、干細(xì)胞標(biāo)記分子表達(dá)增高，而且還上調(diào)表達(dá)干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，并且這些變化對(duì)結(jié)直腸癌的演進(jìn)可能具有重要意義。
　　第三部分 microRNA-378對(duì)CD133分子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制
　　目的：生物芯片分析正常腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中microRNA表達(dá)差異;生物信息學(xué)分析探尋可能對(duì)CD133分子具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的microRNA。構(gòu)建Dual luciferase assay報(bào)告質(zhì)粒，luciferase assay證實(shí)

19、microRNA對(duì)CD133分子轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。
　　方法：收集33例結(jié)直腸癌手術(shù)切除新鮮腫瘤標(biāo)本、遠(yuǎn)端組織標(biāo)本、息肉標(biāo)本，Real-time PCR研究不同組織中CD133分子的轉(zhuǎn)錄水平。生物芯片分析6例正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌三種組織中microRNA的差異表達(dá)。生物信息學(xué)分析可能與CD133分子3'UTR具有潛在結(jié)合位點(diǎn)的microRNA，及其結(jié)合位點(diǎn)序列。RT-PCR擴(kuò)增CD133分子3'UTR全長(zhǎng)片段，構(gòu)建CD

20、133/3'UTR-pGL3雙熒光報(bào)告載體，通過(guò)酶切鑒定、PCR鑒定、測(cè)序鑒定后，Luciferase assay研究microRNA378對(duì)CD133分子表達(dá)的調(diào)控作用，同時(shí)以microRNA142-3p作為陽(yáng)性對(duì)照。在此基礎(chǔ)上合成野生型、突變型microRNA378結(jié)合片段，構(gòu)建w378/pGL3和m378/pGL3雙熒光報(bào)告質(zhì)粒，luciferase assay進(jìn)一步研究確定microRNA378對(duì)CD133分子表達(dá)的調(diào)控作用。最

21、后，結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116體外轉(zhuǎn)染microRNA378，流式細(xì)胞術(shù)研究轉(zhuǎn)染前后HCT116表面CD133分子表達(dá)變化，驗(yàn)證microRNA378對(duì)CD133分子表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：(1)與蛋白水平不同，在正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中CD133分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性差異(p＞0.05）;(2)對(duì)正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中microRNA表達(dá)分析顯示，包括microRNA378在內(nèi)，結(jié)直

22、腸癌組織中有8條microRNA表達(dá)顯著下降;(3)通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)microRNA378與CD133分子3'UTR具有潛在的結(jié)合位點(diǎn);(4)成功構(gòu)建了包含CD133分子3'UTR全長(zhǎng)片段的雙熒光報(bào)告載體，CD133/3'UTR-pGL3。luciferaseassay結(jié)果顯示microRNA378能有效抑制報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶的表達(dá)，抑制效率與陽(yáng)性對(duì)照microRNA142-3p相似;(5)成功構(gòu)建包含野生型、突變型microRN

23、A378結(jié)合位點(diǎn)的雙熒光報(bào)告載體w378/PGL3、m378/PGL3，分別通過(guò)luciferase assay研究發(fā)現(xiàn)，microRNA378能有效抑制w378/PGL3報(bào)告載體熒光素酶的表達(dá)，對(duì)m378/PGL3報(bào)告質(zhì)粒無(wú)顯著作用;(6)體外轉(zhuǎn)染microRNA378后，顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT166表面CD133分子表達(dá)，并且抑制作用具有劑量依賴(lài)性。
　　結(jié)論：在正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中CD133分子mR

24、NA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性變化，提示CD133分子在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控;microRNA378在結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中表達(dá)逐步下降，microRNA378對(duì)CD133分子表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。由此提示，結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中microRNA378表達(dá)抑制是導(dǎo)致CD133分子表達(dá)異常增高的分子機(jī)制之一，值得進(jìn)一步深入探討。
　　綜上所述，本研究獲得以下研究結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中CD133分子表達(dá)

25、逐步增高，CD133分子的表達(dá)與結(jié)直腸癌的演進(jìn)具有相關(guān)性;同時(shí)結(jié)果還顯示，結(jié)直腸組織中CD133分子的表達(dá)與腫瘤的病理分期、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者生存期等病理因素具有相關(guān)性，提示CD133分子在結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程表達(dá)分析具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。(2)證實(shí)正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中，CD44分子呈上調(diào)表達(dá)，與CD133分子表達(dá)一致。進(jìn)而證實(shí)在結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中，干細(xì)胞相關(guān)基因oct-4的表達(dá)逐步增高，與CD13

26、3分子的表達(dá)具有相關(guān)性，并且在結(jié)直腸癌組織中兩者有共表達(dá)。(3)揭示正常結(jié)直腸組織、息肉組織、結(jié)直腸癌組織中CD133分mRNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著變化;結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中共有8條microRNA表達(dá)顯著下降，通過(guò)生物信息學(xué)分析、dual luciferase assay、體外轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)，首次證實(shí)microRNA378對(duì)CD133分子具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)提示，CD133分子具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中microRNA378表達(dá)