ROS在Bcl-2抑制劑抗淋巴瘤和肝細胞癌中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　誘導細胞凋亡是腫瘤治療最基本的理念之一,Bcl-2家族抗凋亡蛋白作為目前研究最深入的調控線粒體途徑凋亡的一類分子,其靶向抑制劑的開發(fā)和機制研究成為了近年來的熱點。靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白的小分子化合物在許多臨床前期實驗中已被證實具有較好的抗瘤效應。淋巴瘤和肝癌作為我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤,死亡率較高,目前的治療措施效果不夠理想,副作用較大,急需靶向性較強的藥物。前期大量研究已經證實淋巴瘤和肝癌的發(fā)生、發(fā)展及治療

2、抵抗均與Bcl-2家族抗凋亡蛋白的過表達密切相關,是應用Bcl-2抑制劑進行靶向治療的理想模型。ROS是細胞在代謝過程中產生的活性氧簇,密切參與了多種生理及病理過程的調節(jié)。近年來ROS在調控細胞自噬和凋亡中的雙重作用越來越受到關注,但有關Bcl-2抑制劑誘導的ROS在抗癌中的具體作用和機制還不清楚,亟待深入闡明。
　　研究目的:
　　ROS在Bcl-2抑制劑抗淋巴瘤和肝細胞癌中的作用及機制研究。
　　研究方法:

3、　　選取人淋巴瘤細胞系Namalwa和肝癌細胞系HepG2、Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5為細胞模型。將不同濃度的Bcl-2抑制劑在不同時間點處理細胞后,采用CCK-8檢測細胞存活率,臺盼藍計數細胞總的死亡率,TUNEL-FITC檢測凋亡細胞數量,Westernblot檢測凋亡相關分子變化,ELISA試劑盒檢測Caspase3酶活性變化。用Bcl-2抑制劑處理細胞后,Westernblot檢測自噬相關蛋白LC3和P62變化,并

4、用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3形成自噬小體情況,DCFH-DA熒光探針檢測細胞內總ROS的變化。Bcl-2抑制劑單獨或聯(lián)合抗氧化劑NAC或JNK抑制劑處理細胞后,Annexin-PI染色觀察細胞凋亡變化,Westernblot檢測凋亡及自噬相關分子的變化。
　　研究結果:
　　1.ROS在左旋棉酚抗淋巴瘤中的作用及機制。
　　(1)左旋棉酚劑量依賴性地抑制淋巴瘤Namlaw細胞的增殖并促進細胞的死亡;(2)左旋棉酚能升

5、高Namlaw細胞內的ROS水平;
　　(3)抗氧化劑NAC可抑制左旋棉酚誘導的細胞自噬;
　　(4)抗氧化劑NAC阻止左旋棉酚介導的HMGB1從胞核到胞質的轉位;
　　(5)抗氧化劑NAC顯著促進了左旋棉酚的促細胞凋亡能力。
　　2.ROS在新型棉酚衍生物ApoG2抗肝細胞癌中的作用及機制。
　　(1)ApoG2誘導了肝癌細胞HepG2和Hep3B的自噬發(fā)生;
　　(2)ApoG2打斷了Belin1

6、和Bcl-2之間的相互作用;
　　(3)ApoG2促進了HepG2和Hep3B細胞ROS的升高;
　　(4)ApoG2誘導的自噬能被抗氧化劑NAC所拮抗;
　　(5)抗氧化劑NAC增強了ApoG2誘導細胞凋亡的能力。
　　3.ROS在ABT-737抗肝細胞癌中的作用及機制。
　　(1)高表達Bcl-2和Bcl-xl的HepG2和Hep3B細胞系對ABT-737不敏感,而高表達Bcl-xl但無表達或低表達Bc

7、l-2的肝癌細胞系對ABT-737較為敏感;
　　(2)ABT-737在HepG2細胞更容易誘導細胞自噬發(fā)生;
　　(3)ABT-737在HepG2細胞和Huh7細胞均誘導了ROS的升高,在Huh7細胞變化更為明顯;
　　(4)ABT-737通過ROS差異性地激活了JNK,ABT-737在HepG2細胞早期瞬時激活JNK,而在Huh7細胞則持續(xù)激活JNK;
　　(5)在HepG2細胞,ABT-737聯(lián)合抗氧化劑N

8、AC或JNK抑制劑SP600125均抑制了細胞自噬水平,促進細胞的凋亡;在Huh7細胞,抗氧化劑NAC或JNK抑制劑SP600125均抑制了ABT-737誘導的細胞凋亡。
　　結論:
　　(1)左旋棉酚能通過ROS誘導淋巴瘤細胞發(fā)生自噬,這種自噬是利于細胞存活的,抗氧化劑能通過抑制自噬促進左旋棉酚誘導的細胞凋亡;ROS介導自噬發(fā)生可能與胞核HMGB1向胞質的轉位增加有關。
　　(2)ApoG2能通過ROS誘導肝癌細胞發(fā)

9、生保護性自噬,其機制涉及ROS介導的ERK和JNK通路激活以及胞核HMGB1向胞質的轉位增加;抗氧化劑NAC能增強ApoG2的抗瘤效應。
　　(3)不同肝癌細胞系對ABT-737的敏感性不同,ROS-JNK通路的激活程度不同是造成這種差異性的重要原因。在高表達Bcl-2的HepG2細胞,ABT-737通過激活低水平的ROS在早期瞬時激活了JNK;在低表達Bcl-2的Huh7細胞則通過激活高水平的ROS持續(xù)激活了JNK;ABT-73