三種蠕形螨組織化學(xué)、酶組織化學(xué)及山羊蠕形螨酶學(xué)、分子生物學(xué)研究.pdf

1、目的：人體蠕形螨（human Demodex）寄生于人毛囊、皮脂腺內(nèi)，可引起痤瘡、毛囊炎、酒渣鼻、瞼緣炎、脫發(fā)等癥。山羊蠕形螨（Demodex caprae）能引起羊皮皮脂腺囊腫，致使板皮穿孔，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前有關(guān)蠕形螨的流行病學(xué)及治療藥物的研究較多，而其超微結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)、致病機(jī)理及分子生物學(xué)方面的研究因技術(shù)瓶頸的限制進(jìn)展困難。本實(shí)驗(yàn)在探索活蠕標(biāo)本顯微處理技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立蠕形螨整體染色法，應(yīng)用組織化學(xué)技術(shù)、酶組織化學(xué)技

2、術(shù)觀察兩種人體蠕形螨和山羊蠕形螨的形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、酶及其在體內(nèi)的分布。應(yīng)用酶學(xué)方法測定山羊蠕形螨體內(nèi)酯酶及蛋白酶的活性。經(jīng)方法改良，提取山羊蠕形螨基因組DNA。目的是為今后從染色法、酶學(xué)、分子生物學(xué)角度研究蠕形螨的結(jié)構(gòu)、生理、分類和致病機(jī)理鋪平道路。 方法：用自制刮片加壓刮取人額部皮脂；切開新鮮山羊皮下結(jié)節(jié)取出其中干酪樣物；將標(biāo)本充分浸沒于洗滌劑中，在解剖鏡直視下，用自制挑螨針將螨從皮脂中分離并反復(fù)清洗干凈。將潔凈活蠕

3、分類置于超純水中，于—20℃冷凍48小時(shí)后，采用自創(chuàng)的蠕形螨整體染色技術(shù)染色：用Giemsa染料染色顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu)，碘液染色顯示糖原，油溶紅O染色顯示脂類，甲基綠染色顯示DNA。采用Gomori法對酸性磷酸酶、堿性磷酸酶進(jìn)行染色，采用Gomori醋酸—α—萘酯法對酯酶進(jìn)行染色，采用Tween法對脂肪酶進(jìn)行染色。在解剖顯微鏡直視下，將潔凈新鮮的山羊蠕形螨置于自制冰冷微型研缽中研磨粉碎，冷凍離心，取上清液為酶源。參照Asperene的方法，以

4、醋酸—α—萘酯為底物，固藍(lán)B鹽為顯色劑，在600nm波長下測吸光度來測定山羊蠕形螨酯酶活性；制作1‰明膠、1％瓊脂平板，打孔，在孔中滴加50μl酶源，30℃作用4小時(shí)后考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測山羊蠕形螨蛋白酶活性。用改進(jìn)法提取山羊蠕形螨的基因組DNA，以瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。 結(jié)果：經(jīng)過組織化學(xué)染色后，三種蠕形螨內(nèi)部結(jié)構(gòu)、糖原、酯類及DNA著色。經(jīng)過酶組織化學(xué)染色，三種蠕形螨體內(nèi)酸性磷酸酶、脂肪酶所在部位被染成棕

5、黑色，堿性磷酸酶所在部位被染成黑色，酯酶所在部位被染成紫紅色。Asperene法測酯酶活性，酶源組吸光度為0．205±0．027，陰性對照組吸光度為0．090±0．008，兩組間有顯著差異（P<0．01）。以明膠平板法測定山羊蠕形螨蛋白酶活性，考馬斯亮藍(lán)R250染色后酶源所在孔周圍形成透明環(huán)，說明酶源中含有能消化明膠的蛋白酶。用改進(jìn)的方法，成功用5000條山羊蠕形螨提取出基因組DNA，瓊脂糖電泳顯示為一高分子量DNA條帶，紫外分光光度計(jì)

6、檢測OD260/OD280大于1．6。 結(jié)論：自創(chuàng)的蠕形螨整體染色法解決了蠕形螨整體染色顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu)的問題。發(fā)現(xiàn)三種蠕形螨體內(nèi)含有大量的糖原、酯類和DNA，具有酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酯酶和脂肪酶活性。山羊蠕形螨體內(nèi)酯酶及蛋白酶活性較高。這支持蠕形螨以脂類和角蛋白為食的觀點(diǎn)，它可能是一種脂螨。同時(shí)酶可能是蠕形螨致病的化學(xué)物質(zhì)。成功提取出高質(zhì)量的山羊蠕形螨基因組DNA。以上創(chuàng)新性工作為今后從染色法、酶學(xué)、分子生物學(xué)角度研究蠕形螨的