基于髓過氧化物酶的炎癥分子成像及熒光示蹤小鼠T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬以神經(jīng)炎癥中的關(guān)鍵酶MPO為靶點(diǎn)，構(gòu)建MPO可特異性激活的磁共振智能探針及熒光智能探針，并對(duì)其在示蹤中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)性炎性病灶的應(yīng)用進(jìn)行研究。且擬利用熒光成像對(duì)淋巴細(xì)胞的進(jìn)行體外示蹤初步探討，為多模態(tài)成像奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分 靶向MPO的磁共振成像評(píng)估多發(fā)性硬化聯(lián)合治療的動(dòng)物模型研究
　　目的:醋酸格拉默(Glatiramer acetate，GA)通過產(chǎn)生免疫抑制性Th2淋巴細(xì)胞被用于治療MS;4-Aminob

2、enzoic acid hydrazide(ABAH)是一種特異性MPO酶活性抑制劑。本研究擬以MPO為靶點(diǎn)，通過MPO特異性分子探針磁共振成像評(píng)估兩種藥物聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)動(dòng)物模型的療效。
　　材料與方法:SJL小鼠皮下注射髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(Proteolipidprotein，PLP)誘導(dǎo)EAE模型小鼠110只。記誘導(dǎo)當(dāng)天

3、為第0天，急性期為第10天，追蹤至第20天。小鼠隨機(jī)分為4組，生理鹽水對(duì)照組200μL，bid(n=5)，ABAH組20mg/kg,bid(n=30),GA75μg,qd組(n=30)及ABAH20mg/kg,bid及GA75μg，qd聯(lián)合治療組(n=40)。5只假手術(shù)小鼠經(jīng)同樣方式誘導(dǎo)，但用PBS代替PLP。每天2次進(jìn)行臨床評(píng)分評(píng)估，并觀察小鼠生存率。合成MPO可特異性激活的智能探針bis-5HT-DTPA-Gd(MPO-Gd)，選擇

4、急性期不同治療組小鼠行磁共振T1WI平掃及增強(qiáng)掃描。結(jié)合平掃及增強(qiáng)后60min圖像分析病灶的數(shù)目，病灶體積及病灶對(duì)比噪聲比。成像小鼠行HE，抗MPO及堅(jiān)考藍(lán)染色，評(píng)估病灶的炎性浸潤(rùn)，MPO表達(dá)及脫髓鞘程度。統(tǒng)計(jì)采用Student's t-test，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:EAE小鼠模型誘導(dǎo)成功。觀察至急性期，可見聯(lián)合治療組小鼠發(fā)病晚，且疾病嚴(yán)重程度明顯輕于單藥治療組(ABAH P＜0.001，GAP＜0.05)。

5、觀察至第20天，綜合整個(gè)疾病進(jìn)程，聯(lián)合治療組臨床評(píng)分低，且疾病嚴(yán)重程度明顯輕于單藥治療組(ABAH P＜0.05，GAP＜0.05)，生存率也高。在急性期成像，分析不同治療組小鼠的平掃及MPO-Gd增強(qiáng)60min影像結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的病灶數(shù)目減少(ABAH P＜0.01，GAP＜0.05)，病灶的體積明顯減小(ABAH P＜0.05，GAP＜0.05);對(duì)比噪聲比也明顯減低(ABAHP＜0.01，GAP＜0.05)。病理結(jié)果同樣顯示

6、聯(lián)合治療組腦內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，MPO的表達(dá)及髓鞘破壞的程度均減低。
　　結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GA與ABAH低劑量聯(lián)合治療較單藥治療效果好。以MPO為靶點(diǎn)的MPO-Gd智能探針MR成像通過示蹤腦內(nèi)活動(dòng)性病灶，準(zhǔn)確反映這一療效，同臨床表現(xiàn)及病理結(jié)果相符。
　　第二部分 髓過氧化物酶特異性熒光探針的特性探索及初步應(yīng)用
　　目的:基于MPO-Gd分子探針合成原理，為擴(kuò)展MPO為靶點(diǎn)的分子成像應(yīng)用范圍，本實(shí)驗(yàn)擬合成一種MPO可

7、激活的酶活性智能熒光探針，并對(duì)其在體內(nèi)外靶向炎性病變的特性及應(yīng)用進(jìn)行初步探索。
　　材料與方法:以5-羥色胺（5-Hydroxy tryptmamine，5-HT）為底物，接以生物素基團(tuán)合成MPO可激活的熒光探針，進(jìn)而通過接以熒光基團(tuán)的鏈酶親和素同探針中生物素的特異性結(jié)合對(duì)MPO進(jìn)行成像。體外，包埋及未包埋人MPO的基質(zhì)膠鋪于96孔板中，按順序分別加入熒光探針，清洗;加入不同濃度鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物，清洗，對(duì)基質(zhì)膠行熒光成像。在體

8、，將包埋不同濃度人MPO的基質(zhì)膠注入小鼠皮下，并尾靜脈分別注入MPO探針及鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物。肺炎鏈球菌皮下注射制作小鼠皮下細(xì)菌感染模型，同樣經(jīng)尾靜脈注入MPO探針和鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物，并皮下注入Sytox Green綠色熒光蛋白來檢測(cè)局部炎性粒細(xì)胞凋亡情況。以上動(dòng)物模型分別在注入熒光探針后0，15，30，45，60min行熒光成像。沙門氏桿菌脊髓鞘內(nèi)注射制作小鼠腦膜炎感染模型，分離腦單個(gè)核細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)分析腦內(nèi)髓系細(xì)胞浸潤(rùn)情況，

9、并取腦組織分析MPO活性。同樣尾靜脈注入MPO探針和鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物，60min后取腦組織，離體熒光成像。
　　結(jié)果:MPO特異性熒光探針可以成功合成。體外基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)熒光成像可見MPO陰性的基質(zhì)膠熒光成像為陰性，而MPO陽(yáng)性的基質(zhì)膠內(nèi)各孔可見熒光強(qiáng)度升高，且升高程度同鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物的濃度趨勢(shì)相同。說明MPO探針可被激活并發(fā)生局部寡聚化，且生物素-鏈酶親和素兩步法熒光成像可行。小鼠皮下包埋MPO基質(zhì)膠成像可見MPO陽(yáng)性基質(zhì)

10、膠部位熒光強(qiáng)度明顯升高，且信號(hào)的強(qiáng)度升高趨勢(shì)同MPO濃度升高趨勢(shì)相關(guān)（r2=0.9572）。肺炎鏈球菌皮下感染小鼠的60min熒光成像可見MPO探針可靶向聚集到感染部位，呈現(xiàn)紅色熒光，同局部凋亡中性粒細(xì)胞的綠色熒光相吻合，說明局部激活的炎性細(xì)胞凋亡，釋放MPO并可被MPO熒光探針檢測(cè)到。鞘內(nèi)注射沙門氏桿菌的腦膜炎小鼠造模后24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)分析可見腦內(nèi)存在大量髓系細(xì)胞的浸潤(rùn)。病變腦MPO活性結(jié)果顯示腦膜炎小鼠腦內(nèi)MPO活性明顯升高，說

11、明腦膜炎小鼠建模成功。模型小鼠腦組織離體熒光成像可見病變腦膜呈明顯條狀強(qiáng)化，而正常鼠腦未出現(xiàn)此強(qiáng)化。說明MPO探針可跨越血腦屏障，為中樞的MPO激活而顯像。
　　結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)中，我們成功合成一種新的MPO可以激活的酶活性熒光探針，其同鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物兩步法成像可行。體外及在體（中樞及外周）熒光成像表明此探針可特異性靶向MPO存在部位，進(jìn)而對(duì)活動(dòng)性炎性病灶成像。
　　第三部分 熒光示蹤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫治療膠質(zhì)瘤初

12、探
　　目的:利用熒光成像的高敏感性優(yōu)勢(shì)，本研究擬通過對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞表面生物素化，通過鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物間接對(duì)T淋巴細(xì)胞靶向生物素化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外熒光示蹤，并對(duì)其特異性靶向殺傷作用進(jìn)行初步探索。
　　材料與方法:小鼠脾臟陽(yáng)性選擇分離CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞并刺激增殖1-2天，得到激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。慢病毒轉(zhuǎn)染法激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行生物素化并分析轉(zhuǎn)染效率。Sulfo-NHS-生物素對(duì)激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

13、進(jìn)行表面蛋白共價(jià)結(jié)合法生物素化，并分析至72小時(shí)時(shí)的標(biāo)記效率及T淋巴細(xì)胞存活率。通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面生物素化，并生物熒光素酶轉(zhuǎn)染觀察熒光素酶分泌情況。將生物素化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞同激活的T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)24小時(shí)，觀察殺傷效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用Student's t-test，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染法生物素化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞效率較低(15.50±3.027％)，且細(xì)胞損傷嚴(yán)重。而共

14、價(jià)結(jié)合細(xì)胞表面生物素化的方法可以對(duì)激活的T淋巴細(xì)胞高效標(biāo)記（98.36圭0.6129％）。體外通過流式分析術(shù)可以敏銳檢測(cè)到標(biāo)記以鏈酶親和素?zé)晒馓结樀募せ畹腡淋巴細(xì)胞，且檢測(cè)到生物素化的T淋巴細(xì)胞72小時(shí)以內(nèi)活性不受影響并細(xì)胞標(biāo)記不丟失。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可以被慢病毒成功轉(zhuǎn)染，細(xì)胞表面表達(dá)生物素效率較高，且細(xì)胞存活良好。體外T淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果表明以鏈酶親和素為橋梁的靶向組T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤效果最好，腫瘤形態(tài)發(fā)生明顯改變，腫瘤表達(dá)熒光

15、量降低，且可見標(biāo)記以熒光探針的T淋巴細(xì)胞聚集于腫瘤群落周圍。利用生物熒光素酶檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)分泌情況發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組及非靶向組，靶向組腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制（對(duì)照組P＜0.001;非靶向組P＜0.01)。
　　結(jié)論:本研究中利用共價(jià)結(jié)合表面生物素化并鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞靶向生物素化膠質(zhì)瘤的體外熒光示蹤。鏈酶親和素增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)生物素化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的靶向及殺傷作用。
　　展望:實(shí)現(xiàn)M

16、RI同熒光成像結(jié)合的雙模態(tài)成像。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫治療膠質(zhì)瘤中細(xì)胞示蹤并復(fù)雜腫瘤免疫微環(huán)境的監(jiān)測(cè)，可通過細(xì)胞表面熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞體內(nèi)熒光示蹤;結(jié)合MPO-Gd增強(qiáng)圖像來評(píng)價(jià)T淋巴細(xì)胞免疫治療后膠質(zhì)瘤周圍炎性免疫微環(huán)境的變化，綜合評(píng)價(jià)免疫治療的療效并進(jìn)行機(jī)制研究。
　　總之，本研究中，我們合成了MPO特異性磁共振智能探針和熒光智能探針;通過MPO可激活的智能探針，將MPO作為一個(gè)敏感的成像靶點(diǎn)對(duì)中樞及外周的活