植酸對缺血再灌注小鼠腦組織的保護(hù)作用及對p-Akt,NF-κB，MMP-9及claudin-5調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:腦血管病是造成我國居民死亡和殘疾的首位原因，其中以缺血性腦血管病最為常見。盡管缺血性腦血管病的病理、生理學(xué)機(jī)制已經(jīng)取得了一些研究成果，但是尋找積極有效的藥物治療仍是當(dāng)前缺血性腦卒中的難點。
　　炎癥和凋亡損傷在腦缺血的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，因此可作為治療缺血后繼發(fā)性腦損傷的靶點。試驗表明，腦缺血后位于缺血半暗帶的神經(jīng)元可以存活數(shù)小時，甚至數(shù)天。這種延遲的組織損傷過程包括細(xì)胞凋亡和炎癥。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種特殊形式，繼

2、發(fā)于腦缺血后，取決于細(xì)胞凋亡信號和生存信號之間的平衡。研究證實凋亡出現(xiàn)在外圍的缺血半暗帶，并且磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路可以介導(dǎo)腦缺血和再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的生存。Akt激活后可以通過磷酸化作用滅活凋亡效應(yīng)分子，如糖原合成酶激酶3(glycogensynthasekinase，GSK-3β)。GSK3β通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)p65亞基的活化調(diào)控炎癥反應(yīng)。NF-κB是一種大量存在于組織中的轉(zhuǎn)錄因

3、子，調(diào)節(jié)參與炎癥，細(xì)胞生存和凋亡的基因表達(dá)。在腦缺血再灌注后，特別是神經(jīng)元中，NF-κB被激活。同時有研究證明，在永久性腦缺血模型中抑制NF-κB可以減少梗死體積，減輕腦損傷，特別是NF-κB可以調(diào)節(jié)某些前炎介質(zhì)的表達(dá)，如金屬基質(zhì)蛋白-9(MMP-9)。過多的金屬基質(zhì)蛋白是有害的，直接從腦組織中注射MMP-9可以引起細(xì)胞死亡和炎癥。
　　植酸（Inositolhexaphosphate，IP6）是從谷物中發(fā)現(xiàn)的一種有機(jī)磷酸類的物質(zhì)

4、，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用，尤其植酸對心臟再灌注損傷有保護(hù)作用，因此受到了人們的廣泛關(guān)注。但是植酸是否對腦缺血再灌注的腦組織有保護(hù)作用及其作用機(jī)制如何，有待于我們的進(jìn)一步研究。
　　方法:采用成年健康雄性CD1小鼠，應(yīng)用改良后的Longa線栓法建立短暫小鼠右側(cè)缺血再灌注(tMCAO)模型。實驗動物隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組(tMCAO組)、植酸低劑量組(IP6-Lgroup，tMCAO+Inositol

5、hexaphosphate75mg/kg)、植酸高劑量組(IP6-Hgroup，tMCAO+Inositolhexaphosphate125mg/kg)。植酸干預(yù)組于缺血再灌注后立即予小鼠腹腔注射植酸溶液，Sham組和tMCAO組則腹腔注射等容量生理鹽水。術(shù)后24h對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分完畢后將小鼠斷頭處死，用干濕重法測定腦組織含水量，用2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazoliumchloride，TT

6、C)染色法測定腦梗死體積，用免疫組化，免疫印記(Westernblot)和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)測定p-Akt、NF-κB、MMP-9和claudin-5的表達(dá)，用尼氏染色(Nissl'sstaining)測定細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　1、神經(jīng)功能評分:小鼠缺血再灌注24小時后采用改良的5分法進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評分，每組24只小鼠。與Sham組相比，tMCAO組的行為學(xué)評分明顯高于Sham組。與tMC

7、AO組相比，IP6-L組和IP6-H組明顯改善了神經(jīng)功能學(xué)評分（IP6-Lvs.tMCAO:3.16±0.70vs.3.67±0.87，P＜0.05;IP6-Hvs.tMCAO:2.67±0.87vs.3.67±0.87，P＜0.01），IP6-L組與IP6-H組相比，IP6-H組行為學(xué)評分更少（IP6-Lvs.IP6-H:3.16±0.70vs.2.67±0.87，P＜0.05）。
　　2、腦梗死體積(％HLV)的測定:Sham

8、組沒有觀察到腦梗死體積，而tMCAO組可以在皮層觀察到白色的梗死區(qū)域。IP6-L組與tMCAO組相比，IP6-L組梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(IP6-Lvs.tMCAO:47.20％±6.16％vs.62.45％±9.41％P＜0.01)。IP6-H組與tMCAO組相比，梗死體積有所減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(IP6-Hvs.tMCAO:62.45％±9.41％vs.34.59％±7.37％P＜0.01)。IP6-L組與IP6-H組

9、相比，IP6-H組梗死體積減小的更為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（IP6-Lvs.IP6-H:47.20％±6.16％vs.34.59％±7.37％P＜0.05）。
　　3、腦組織含水量測定:Sham組同側(cè)腦組織含水量為79.80％±0.98％。與tMCAO組相比，IP6-L組和IP6-H組腦組織含水量均降低并具有統(tǒng)計學(xué)意義(tMCAOvs.IP6-L:85.12％±1.67％vs.82.73％±1.62％，P＜0.05;tMCAOv

10、s.IP6-H:85.12％±1.67％vs.81.13％±0.72％,P＜0.05),IP6-L組與IP6-H組相比，IP6-H組更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（IP6-Lvs.IP6-H:82.73％±1.62％vs.81.13％±0.72％,P＜0.05)。
　　4、植酸對p-Akt，NF-κB，MMP-9和claudin-5表達(dá)的影響:免疫組化的結(jié)果顯示，IP6-L組和IP6-H組極大的提高了p-Akt的陽性細(xì)胞數(shù)，植酸治療組明顯

11、減少了NF-κB和MMP-9的陽性細(xì)胞的表達(dá)。在蛋白水平，植酸上調(diào)了p-Akt和claudin-5的表達(dá)，下調(diào)了NF-κB和MMP-9的表達(dá)。在mRNA水平，IP6-L組與IP6-H組的NF-κB和MMP-9表達(dá)水平明顯降低。
　　5、植酸減少了細(xì)胞凋亡:尼氏染色在tMCAO模型上顯示了植酸干預(yù)后細(xì)胞延遲死亡的特征。Sham組未出現(xiàn)細(xì)胞死亡，tMCAO組出現(xiàn)細(xì)胞的減少，神經(jīng)元的損傷和軸突的扭曲。與tMCAO組相比，IP6-L組和I

12、P6-H組則減少了上述細(xì)胞的死亡。
　　6、植酸可以改善血腦屏障的通透性:MMP-9和claudin-5與血腦屏障的完整性相關(guān)。與tMCAO組相比，腦缺血再灌注后24小時植酸低劑量和高劑量組claudin-5的表達(dá)明顯上調(diào)，MMP-9的表達(dá)明顯下調(diào)。WesternBlot及RT-qPCR均可證實。
　　結(jié)論:植酸改善神經(jīng)功能評分、減輕腦水腫及梗死體積，對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與植酸可以上調(diào)p-Akt、cl