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文檔簡(jiǎn)介
1、病毒性疾病,尤其是傳染性病毒疾病,嚴(yán)重危害著人類的生命安全及社會(huì)活動(dòng)的有序進(jìn)行。了解病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染機(jī)制與致病機(jī)理,有利于病毒防治藥物的開發(fā),從而從源頭上阻斷病毒疾病的發(fā)生。單病毒示蹤技術(shù)著眼于探索單個(gè)病毒顆粒與宿主細(xì)胞之間復(fù)雜的動(dòng)態(tài)相互作用,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒侵染過程的每個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)示蹤,為成功揭示病毒侵染機(jī)理提供了條件。然而,傳統(tǒng)的利用熒光染料和熒光蛋白標(biāo)記病毒的方法存在著熒光強(qiáng)度低、抗光漂白性差等缺點(diǎn),難以實(shí)現(xiàn)單病毒的長(zhǎng)時(shí)間
2、可視。而利用量子點(diǎn)這種具有優(yōu)異發(fā)光特性的無機(jī)熒光納米材料標(biāo)記病毒,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)病毒侵染宿主路徑和行為的長(zhǎng)時(shí)間示蹤,有利于深入了解病毒侵染機(jī)制。本文即以一種典型的囊膜病毒,呼吸道合胞病毒(RSV)為研究對(duì)象,針對(duì)病毒侵染過程中的關(guān)鍵事件,首先建立了一系列量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的方法,然后將其用于活細(xì)胞內(nèi)病毒輸運(yùn)途徑的實(shí)時(shí)分析中。主要研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)方面:
1.呼吸道合胞病毒的高效量子點(diǎn)標(biāo)記
(1)利用病毒在組氨酸標(biāo)簽修飾
3、的細(xì)胞內(nèi)的自組裝過程原位標(biāo)記呼吸道合胞病毒。標(biāo)記策略的基礎(chǔ)是呼吸道合胞病毒在宿主細(xì)胞膜上裝配和釋放時(shí)細(xì)胞表面會(huì)表達(dá)大量病毒的膜蛋白。利用EDC/NHS對(duì)含組氨酸標(biāo)簽(His-tag)的多肽羧基端進(jìn)行活化后,可使其與處于細(xì)胞表面的病毒膜蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒膜蛋白的His-tag標(biāo)記,當(dāng)病毒從此細(xì)胞出芽后即可帶上His-tag。次氮基三乙酸-Ni(NTA-Ni)修飾的QDs可通過Ni與組氨酸標(biāo)簽的螯合作用與該病毒結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)
4、病毒的量子點(diǎn)標(biāo)記。對(duì)病毒免疫熒光與量子點(diǎn)熒光成像的共定位分析顯示有71.5±4.1%的病毒能被量子點(diǎn)標(biāo)記上,說明該方法具有較高的標(biāo)記效率。并且我們發(fā)現(xiàn)利用此原位標(biāo)記方法獲得的QDs標(biāo)記病毒,比直接對(duì)活病毒修飾His-tag及偶聯(lián)QDs獲得的標(biāo)記病毒感染力高455倍左右,說明此原位標(biāo)記方法有利于獲得高感染力的標(biāo)記病毒。
(2)利用生物素化的宿主細(xì)胞膜蛋白及核酸染料對(duì)病毒進(jìn)行原位雙標(biāo)記,以監(jiān)測(cè)病毒進(jìn)入宿主的早期事件。根據(jù)囊膜病毒出
5、芽時(shí)一些宿主細(xì)胞膜蛋白會(huì)摻入成熟的病毒體中的特點(diǎn),我們提出了一種利用宿主的膜蛋白對(duì)呼吸道合胞病毒進(jìn)行標(biāo)記的策略。首先通過直接將細(xì)胞與生物素化試劑孵育來使細(xì)胞膜蛋白被修飾上生物素分子。然后讓病毒感染該生物素化的細(xì)胞,并在其中增殖,當(dāng)成熟的病毒在宿主中組裝并最終在細(xì)胞膜表面釋放時(shí),生物素化的宿主膜蛋白可以自然地嵌入病毒囊膜中。此外,在病毒擴(kuò)增過程中外加可綁定RNA的核酸染料可以使病毒的RNA也可以同時(shí)被標(biāo)記上,實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒內(nèi)外組分的原位同時(shí)標(biāo)
6、記。由于病毒表面的生物素分子與鏈霉親和素修飾的量子點(diǎn)能高效率的結(jié)合,使病毒的量子點(diǎn)標(biāo)記效率可以達(dá)到83.7±4.6%。同時(shí)由于生物素修飾的是細(xì)胞膜蛋白,避免了對(duì)病毒表面活性位點(diǎn)的占據(jù),使得量子點(diǎn)標(biāo)記后的病毒仍可以保持95.4%的感染力。最后,通過熒光成像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)量子點(diǎn)與核酸染料雙色標(biāo)記的單個(gè)病毒對(duì)細(xì)胞侵染的早期行為,我們對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)過程及核酸在靠近細(xì)胞膜區(qū)域的快速釋放過程進(jìn)行了分析。
(3)基于病毒自組裝過程的雙色量
7、子點(diǎn)標(biāo)記病毒。由于量子點(diǎn)具有較寬的激發(fā)光譜和窄而對(duì)稱的熒光發(fā)射峰,同時(shí)使用不同發(fā)射的量子點(diǎn)不會(huì)產(chǎn)生光譜重疊,因此非常適合用于多色標(biāo)記成像。而已建立的量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的方法均只使用了單色量子點(diǎn)。為了更好地對(duì)病毒內(nèi)外組分進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像示蹤,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)對(duì)病毒囊膜蛋白和核酸同時(shí)進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記的方法。對(duì)病毒核酸的標(biāo)記基于一個(gè)紅色量子點(diǎn)-分子信標(biāo)基因探針,它可以與病毒基因組中的一段重復(fù)序列雜交,由于信標(biāo)一端帶有猝滅基團(tuán),使其成為一個(gè)由病毒基因組觸
8、發(fā)的熒光開關(guān)。我們?cè)诓《緩?fù)制過程中通過膜通透試劑將該基因探針引入被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),使其與病毒基因組中對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行雜交,實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因組的熒光標(biāo)記。對(duì)病毒膜蛋白的標(biāo)記是通過將病毒表面糖蛋白生物素化,再連接鏈霉親和素偶聯(lián)的綠色熒光量子點(diǎn)。兩個(gè)標(biāo)記步驟均是利用了病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的自組裝過程,并在其大量復(fù)制準(zhǔn)備出胞時(shí)進(jìn)行的。與其他病毒標(biāo)記方法相比,我們這種標(biāo)記策略溫和、對(duì)病毒感染力影響較小,并且可以適用于所有從細(xì)胞質(zhì)膜出芽的囊膜病毒的標(biāo)記。<
9、br> 2.實(shí)時(shí)示蹤量子點(diǎn)標(biāo)記的呼吸道合胞病毒在活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)輸運(yùn)途徑
我們通過對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的長(zhǎng)時(shí)間熒光監(jiān)測(cè),及其與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白和細(xì)胞器的熒光共定位分析,并結(jié)合藥物抑制實(shí)驗(yàn),仔細(xì)研究了呼吸道合胞病毒對(duì)宿主細(xì)胞侵染過程。研究結(jié)果顯示該病毒的內(nèi)在化是一個(gè)快速而高效的過程,且主要包含三個(gè)關(guān)鍵事件:1)發(fā)動(dòng)蛋白和小窩蛋白/脂筏介導(dǎo)的病毒內(nèi)在化;2)微絲依賴的病毒運(yùn)輸過程;3)微管依賴的病毒快速運(yùn)輸過程及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的積累。此外,
10、該研究結(jié)果同時(shí)也表明,我們的量子點(diǎn)標(biāo)記策略不僅不會(huì)影響病毒的內(nèi)在化途徑,還有助于直觀地研究病毒侵染過程。
綜上所述,本文利用囊膜病毒在宿主細(xì)胞中的增殖和自組裝過程,建立了對(duì)于病毒內(nèi)外組分的量子點(diǎn)標(biāo)記方法,并將其用于對(duì)病毒侵染宿主過程的實(shí)時(shí)示蹤分析。本文提出的原位標(biāo)記策略避免了對(duì)活病毒的直接操作,大大降低了量子點(diǎn)標(biāo)記對(duì)病毒感染力的影響,并且實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒囊膜和核酸的雙色量子點(diǎn)標(biāo)記,有望對(duì)納米材料標(biāo)記成像策略提供新思路,并拓展無機(jī)熒
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