生發(fā)基質-腦室內出血對早產兔腦組織葡萄糖轉運蛋白的影響.pdf

1、目的:
　　生發(fā)基質-腦室內出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricularhemorrhage，GM-IVH)是早產兒顱內出血最常見的類型。在過去的幾十年中，隨著醫(yī)療技術水平及護理水平的提高，早產兒的存活率顯著增加，但對于孕周小，出生體重低的早產兒而言，GM-IVH的發(fā)病率仍是一個主要問題。GM-IVH可留有不同程度的神經系統(tǒng)后遺癥，如癲癇、認知異常、腦癱等，因此GM-IVH及其導致的

2、神經系統(tǒng)后遺癥仍然是全球范圍內的重大公共衛(wèi)生問題。當前對于GM-IVH后繼發(fā)性腦損傷機制還不是十分清楚。早產兒發(fā)生GM-IVH后常常合并側腦室擴張，除對癥治療外，目前尚無有效的治療手段，腰椎穿刺是主要的對癥治療方法之一，目的是釋放出聚積在側腦室內和腦脊液中的陳舊出血、增高的蛋白質以及過多的腦脊液，保持腦脊液循環(huán)通路的暢通，防止側腦室持續(xù)擴張，形成嚴重的腦積水，減輕對腦組織的壓迫。通過腰椎穿刺方法，對引流出的腦脊液進行動態(tài)檢測發(fā)現了一個十

3、分突出的現象，這類早產兒腦脊液糖的含量持續(xù)低于正常早產兒參考值，但患兒血糖正常，Volpe總結如下:這種無法用炎癥解釋的腦脊液糖濃度的降低發(fā)生于出血后第1天，5-15天最明顯，常常持續(xù)數周，最長持續(xù)至出血后3個月。大腦的能量來源主要依賴于葡萄糖，而葡萄糖從血液進入腦細胞必須通過葡萄糖轉運蛋白1(glucosetransport1，GLUT1)和葡萄糖轉運蛋白3(glucose transport3，GLUT3)的介導。在先天性GLUT1

4、缺乏癥的患兒中，腦脊液中糖含量低于正常值，而同一時間的血液中的糖濃度是正常的，腦脊液/血葡萄糖之比降低，乳酸的含量正?；蚪档停珻T、MRI腦部影像學正常，EEG表現為背景波較慢，多有彌漫性或局灶性的異常放電，患兒常表現為抗癲癇藥物治療無效的癲癇發(fā)作，發(fā)育遲緩，獲得性小頭畸形，共濟失調、智力低下等。目前對GM-IVH患兒腦脊液糖濃度降低的機制不清楚，是否參與了繼發(fā)性腦損傷也不清楚？最初認為腦脊液糖濃度降低是由于紅細胞的消耗和無氧糖酵解的增

5、加，但隨后均因為腦脊液紅細胞清除后和乳酸濃度正常，糖濃度依然持續(xù)在低水平而被否決，有學者猜測可能因為出血破壞了腦內葡萄糖的轉運導致了腦脊液持續(xù)的糖濃度降低。查閱文獻未見相關的報道。本實驗通過GM-IVH動物模型，應用蛋白印跡實驗方法，定量分析了腦室周圍腦組織GLUT1、GLUT3蛋白的表達，探討GM-IVH后腦脊液糖濃度降低的可能機制，為臨床提供新的治療手段開辟思路。
　　方法:
　　1、將懷孕29天的新西蘭孕兔進行剖宮產，

6、迅速將幼兔取出，并給予保溫、奶粉喂養(yǎng)。將幼兔隨機分為兩組，在生后3小時之內，其中一組的早產兔給予50％的丙三醇，劑量按10ml/Kg，經腹腔注射，另一組的早產兔不給予任何處理。
　　2、兩組早產兔分別于生后24小時接受頭顱超聲檢查，觀察GM-IVH發(fā)生情況。選取接受丙三醇注射后發(fā)生GM-IVH的早產兔15只，為模型組，未給予任何處理的未發(fā)生GM-IVH的早產兔15只，為對照組，然后將兩組分別隨機分為生后24h、48h、72h三個亞

7、組，按上述時間點給予麻醉，由內向外迅速選取腦室周邊區(qū)域組織，一部分新鮮腦組織放入4％多聚甲醛溶液中固定，供后期蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，以觀察早產兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織細胞形態(tài)的變化，另一部分新鮮腦組織立即用液氮冷凍，然后將標本放到-80℃冰箱，供蛋白印跡實驗用，用蛋白印跡法檢測對照組與模型組早產兔腦組織的GLUT1蛋白和GLUT3蛋白的表達。
　　3、統(tǒng)計方法:采用

8、SPSS13.0統(tǒng)計學軟件、Microsoft Excel2003進行數據處理。計量資料以均數±標準差（(x)±SD）表示，均數比較前先行方差齊性檢驗，不同時間點多個樣本均數的比較采用LSD法（Least-significant Difference）檢驗，兩個樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗(Independent Samples Test)，若不滿足方差齊性檢驗則采用秩和檢驗(rank-sum test)的方法。檢驗水準定為0.05

9、，P值小于0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、成功的建立了早產兔Ⅲ度GM-IVH模型
　　通過頭顱超聲、大體標本觀察、腦組織HE染色觀察證實早產兔GM-IVH模型的成功制備。
　　2、腦組織GLUT1蛋白的表達
　　用蛋白印跡實驗方法檢測早產兔腦組織GLUT1的表達，對照組腦組織標本中GLUT1表達量在生后24h、48h、72h是逐漸減少的，三個時間點間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);模

10、型組早產兔腦組織標本中GLUT1表達量在生后24h、48h、72h三個時間點間兩兩比較亦有差異(P＜0.05)，以生后24h最高，其次是生后48h，最后是生后72h;模型組早產兔腦組織標本中GLUT1蛋白量在生后72h低于同一時間點的對照組，而生后24小時、48小時的蛋白量均高于同一時間點的對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、腦組織GLUT3蛋白的表達
　　用蛋白印跡實驗方法檢測早產兔腦組織GLUT3表達，對

11、照組腦組織標本中GLUT3表達量在生后24h、48h、72h是逐漸增多的，三個時間點間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);模型組早產兔腦組織標本中GLUT3表達量在生后24h、48h、72h三個時間點間兩兩比較亦有差異(P＜0.05)，以生后48h最高，其次是生后24h，最后是生后72h，模型組早產兔腦組織標本中GLUT3蛋白量在生后24h與對照驗組同一時間點相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，72h的蛋白量低于同一時間點

12、的對照組，而48小時的蛋白量高于同一時間點的對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、正常早產兔在生后72小時內隨著生后日齡的增長，腦部GLUT1蛋白量是減少的，而GLUT3蛋白量是增多的。
　　2、早產兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織GLUT1表達量的上調，代表一種代償反應，之后的降低導致了腦脊液糖濃度的降低。
　　3、早產兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織GLUT3蛋白量有暫時性的增多，是