臨床因素對精液游離mRNA與microRNA影響的初步研究.pdf

1、目的：精液游離RNA是潛在的男性生殖系統(tǒng)疾病研究及診斷的新分子標志物，影響精液檢驗的一些因素可能會影響精液游離RNA的分析結(jié)果，本實驗主要研究年齡、精液中解脲脲原體（UU）陽性、陰囊熱激、禁欲天數(shù)與精液標本存放溫度等可能影響精液檢驗的臨床因素，對精液中游離mRNA（cfs-mRNA）和游離microRNA（cfs-miRNA）檢測水平的影響。
　　方法：將臨床收集的精液標本依據(jù)以下因素進行分組:①年齡：分為20-25、26-30、

2、31-35、36-40、41歲及以上五組（每組10人）；②精液中UU陽性：排除其他常見生殖系統(tǒng)感染，根據(jù)精液中有無UU DNA分兩組（每組12人）；③陰囊熱激：志愿者（每組5人）每天43℃溫浴30 min，連續(xù)10天，熱激前及熱激開始后每兩周取一次精液，監(jiān)測精液參數(shù)變化，選取溫浴前、精液參數(shù)最差期、精液參數(shù)恢復(fù)期三組精液標本；④禁欲天數(shù)：志愿者4人，禁欲天數(shù)1、2、7、≥13天各取精液一次；⑤精液標本存放溫度：3份精液標本，液化后每份標

3、本分為4℃、-20℃和-70℃三組，依次存放0天、1天、3天、7天、14天、28天。本實驗主要研究臨床因素對檢測結(jié)果的影響，為使結(jié)果便于分析，選用精液參數(shù)正常標本（陰囊熱激后除外）。精液標本液化后離心取精漿，提取RNA前凍存于液氮中。Trizol LS方法提取精漿游離RNA，用不同的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將cfs-mRNA與cfs-miRNA逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA。檢測cfs-mRNAs指標包括ACTB（廣泛表達）、DDX4（睪丸特異性表達）、W

4、FDC9（附睪特異性）、SEMG1(精囊腺特異性)、TGM4（前列腺特異性）；cfs-miRNAs包括miR-30d-5p（廣泛表達）、miR-93-5p（廣泛表達）、miR-514a-3p（睪丸特異性表達）、miR-892a（附睪特異性）、miR-141-3p（精囊腺和前列腺主要表達）、miR-221-3p（睪丸主要表達）。制備mRNA與miRNA標準品，10倍梯度稀釋。進行熒光定量PCR絕對定量分析，計算cfs-mRNA和cfs-m

5、iRNA濃度，結(jié)合精液體積計算總量，統(tǒng)計學(xué)分析上述不同因素對這些組織特異性指標檢測水平的影響。
　　結(jié)果：年齡、精液UU陽性對各cfs-mRNA和cfs-miRNA濃度和總量檢測水平無明顯影響；陰囊熱激會引起cfs-mRNA中的ACTB、DDX4、WFDC9與cfs-miRNA中的miR-514a-3p與miR-221-3p濃度升高，其他cfs-mRNA和cfs-miRNA無明顯變化；隨著禁欲天數(shù)的延長，精液中SEMG1 cfs-

6、mRNA的濃度與總量呈逐漸降低趨勢，其他cfs-mRNA和cfs-miRNA無明顯變化；存放在4℃、-20℃和-70℃的精液標本，隨著放置天數(shù)的延長（≤28天），各cfs-mRNA和cfs-miRNA的濃度無明顯變化。
　　結(jié)論：年齡、精液UU陽性對精液中cfs-mRNA與cfs-miRNA的檢測水平無明顯影響；陰囊熱激主要影響精子發(fā)生，使睪丸來源cfs-mRNA與cfs-miRNA受到明顯影響，對附睪影響次之，而對前列腺與精囊腺