Ephrin-B2基因敲除小鼠腦損傷后反應性星形膠質(zhì)細胞有利于保護組織和促進神經(jīng)功能恢復.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain iniury,TBI)是神經(jīng)外科最常見的疾病,是致死和致殘的主要原因,尤其是青少年。近年來,隨著神經(jīng)外科治療方法和治療藥物的不斷改進、創(chuàng)新,已顯著降低了其死亡率,提高了預后,但治療后的神經(jīng)功能恢復情況仍不太令人滿意,腦損傷后神經(jīng)功能障礙發(fā)生率較高,多數(shù)患者遺留學習記憶能力減弱、肢體功能障礙等問題,這些嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。如何減少后遺癥,提高治療效果,尤其是認知功能和運動能力的改善,一直

2、是神經(jīng)科學界努力探索追求的目標。近來,增強腦損傷后的神經(jīng)保護、減少繼發(fā)性炎癥反應、促進組織修復,愈來愈成為神經(jīng)醫(yī)學界關(guān)注的焦點。Ephrins配體及Eph受體(產(chǎn)生促紅細胞生成素的肝細胞受體,Erythropoietin-Producing Hepatocellular Receptor)統(tǒng)稱為Eph受體家族,是新發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶信號傳導系統(tǒng),Ephrin-B2是該系統(tǒng)中的一名重要成員,參與神經(jīng)細胞間多種作用。在胚胎發(fā)育階段,對神經(jīng)

3、系統(tǒng)的發(fā)育及血管的生成起非常重要的作用;在成年時,它仍然參與細胞間的信號傳導,從而影響細胞行為和組織塑形,如誘導細胞遷移和邊界形成,特別是在腦損傷后的修復過程中。
　　 目的:培育條件性Ephrin-B2基因敲除小鼠,敲除膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達陽性星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的Ephrin-B2基因;建立TBI動物模型;探討Ephrin-B2基因在小鼠腦損傷后表達規(guī)律及神經(jīng)損傷修復過程中的作用。
　　 方法:
　　

4、1 培育Ephrin-B2基因敲除(KO)小鼠:將GFAP-Cre基因型小鼠和Ephrin-B2-LoxP基因型小鼠進行雜交繁殖后代,檢測子代小鼠的基因型。
　　 2 對Ephrin-B2基因敲除小鼠進行健康檢測,以C57BL/6野生型(WT)小鼠作為對照,比較神經(jīng)系統(tǒng)的大體形態(tài),星形膠質(zhì)細胞形態(tài)、數(shù)量及分布。
　　 3 選擇雄性、10～12周、重20～30g、健康的Ephrin-B2基因敲除小鼠120只,相同數(shù)量的健康

5、、雄性C57BL/6野生型小鼠作為對照,建立可控性皮層損傷模型。
　　 4 將兩種TBI小鼠,按四個時間點:3天、7天、14天和21天各分為4組,將無損傷的小鼠作為空白對照。于各時間點采集標本,進行以下檢測:免疫熒光組織化學染色檢測腦損傷后Ephrin-B2蛋白和GFAP的表達、分布情況;Western blotting檢測損傷周圍Ephrin-B2蛋白、磷酸化的Ephrin-B2(pEphrin-B2)蛋白和GFAP的表達改變

6、;Q-PCR檢測損傷周圍及損傷同側(cè)海馬區(qū)域GFAP mRNA表達的動態(tài)變化;Nissl染色檢測損傷后21天時的損傷體積;采用平衡木行走試驗(Beam Walking Test)和轉(zhuǎn)圈試驗(Rotarod Test)進行神經(jīng)功能行為學評分。
　　 5 星形膠質(zhì)細胞劃痕損傷試驗:將兩種小鼠腦皮層星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng),免疫熒光組織化學染色檢測星形膠質(zhì)細胞Ephrin-B2蛋白和GFAP的表達情況,并檢測在損傷后兩種星形膠質(zhì)細胞長入損傷區(qū)域

7、的細胞數(shù)目,檢測在修復過程中的不同表現(xiàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1 Ephrin-B2基因敲除小鼠表現(xiàn)形與C57BL/6野生型小鼠相似,無明顯差別:全腦的大小,重量以及形態(tài)相同,顯微鏡下檢測星形膠質(zhì)細胞形態(tài),大小和分布亦與野生型小鼠無差別,Western Blotting檢測顯示KO小鼠腦皮層GFAP表達略高于WT小鼠。
　　 2 免疫組織學染色顯示Ephrin-B2蛋白在WT小鼠腦損傷后21天內(nèi)在損傷周圍表達逐漸

8、增加,Ephrin-B2蛋白主要表達于GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞膜和突起上。KO小鼠腦損傷后損傷周圍無Ephrin-B2蛋白表達。
　　 3 Western blotting結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠腦損傷后Ephrin-B2,pEphrin-B2和GFAP的表達在損傷周圍明顯增加。盡管Ephrin-B2蛋白表達在腦損傷后第3天時稍下降,但是在3天以后逐漸升高,在21天時最高。pEphrin-B2和GFAP的表達曲線表現(xiàn)為相同的改變趨勢,

9、在第7天時表達量最高。
　　 4 Western blotting結(jié)果還顯示KO小鼠在腦損傷后GFAP的表達明顯高于WT小鼠。WT小鼠GFAP的表達在第7天時最高,而KO小鼠GFAP的表達在21天內(nèi)持續(xù)升高,在第3天時KO小鼠GFAP的表達是WT小鼠的4.7倍,在第7天時是WT小鼠表達量的2.8倍,在第14和21天KO小鼠GFAP的表達仍明顯高于WT小鼠。Q-PCR方法檢測KO小鼠GFAP mRNA的表達均較WT小鼠呈明顯增加(

10、p＜0.05),無論是在損傷周圍還是在同側(cè)海馬區(qū)域,這與GFAP的表達趨勢相同。
　　 5 Nissl染色示Ephrin-B2基因敲除小鼠在腦損傷后21天時形成的損傷空洞體積較小。
　　 6 細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示Ephrin-B2基因敲除后的星形膠質(zhì)細胞在損傷后更易于分裂增殖,更快向損傷區(qū)域聚集。
　　 7 行為學評分示Ephrin-B2基因敲除小鼠在腦損傷后神經(jīng)功能恢復較好。
　　 結(jié)論:WT小鼠腦損傷后,

11、Ephrin-B2配體在損傷周圍的星形膠質(zhì)細胞膜上表達明顯上調(diào),信號傳導增加;Ephrin-B2基因敲除小鼠腦損傷后,Ephrin-B2配體不再表達,致使星形膠質(zhì)細胞活化迅速且明顯增多,在損傷后3天時,GFAP mRNA的表達就已明顯增高,GFAP合成增加,反應性的星形膠質(zhì)細胞增加了神經(jīng)保護作用,減輕了繼發(fā)性組織損傷,從而促進了損傷修復和腦神經(jīng)功能的恢復,減少了后遺癥的發(fā)生。因此,如何定時定量地調(diào)節(jié)Ephrin-B2的信號傳導,從而調(diào)控