內皮素1在星形膠質細胞過表達對小鼠脊髓損傷后運動功能恢復的影響.pdf

1、中樞神經系統(tǒng)的損傷主要是指腦損傷和脊髓的損傷。脊髓損傷可以分為原發(fā)性的脊髓損傷(primary spinal cord injury)和繼發(fā)性的脊髓損傷(secondary spinal cord injury,SSCI),繼發(fā)性脊髓損傷伴隨在原發(fā)性損傷之后。原發(fā)性損傷主要指的是脊髓組織由于受到機械力的作用造成的機械性損傷,如擠壓,撕裂等,繼發(fā)性損傷是在脊髓原發(fā)性損傷以后,由于血脊髓屏障破壞、血管損傷、損傷附近的組織細胞缺氧、組織壞死等

2、造成炎癥細胞的浸入或者損傷周圍組織細胞微環(huán)境分子平衡遭到破壞而引起的更大面積的脊髓損傷。相對于脊髓原發(fā)性損傷的不可控因素,防止繼發(fā)性損傷一直的科學研究的主要目標,但是繼發(fā)性脊髓損傷的出現(xiàn)是一個相當復雜的過程,它包括多種因素的綜合作用。脊髓損傷后眾多對脊髓組織有傷害作用的細胞和分子都是來自循環(huán)系統(tǒng),而這些細胞和分子在正常的生理條件下由于血脊髓屏障的存在是無法進入到脊髓組織當中,當脊髓損傷后由于血脊髓屏障受到破壞,所以這些平時無法進入到脊髓

3、組織的細胞和分子就會進入到脊髓當中,因此原發(fā)性脊髓損傷后防止進一步的血脊髓屏障遭到破壞或者及時修復破壞的血脊髓屏障是防止脊髓繼發(fā)性損傷的重要策略。
　　內皮素是一類血管收縮物質,是一類多肽分子家族,主要有三種亞型:內皮素1(ET-1)、內皮素2(ET-1)、內皮素3(ET-3)和兩種受體A(ETA)和受體B(ETB)。內皮素是目前發(fā)現(xiàn)的最強烈的血管收縮物質,其ETA主要分布在血管平滑細胞,受ETB在體內很多組織細胞都有分布,在中樞

4、神經系統(tǒng)的組織細胞中也有內皮素ETB的發(fā)現(xiàn),尤其在星形膠質細胞,對于其ETB的作用的研究也越來越多。
　　由于血脊髓屏障的主要結構是由血管內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞構成,而血管內皮細胞和星形膠質細胞都有內皮素受體的分布,因此本實驗主要研究了ET-1在星形膠質細胞過表達后對小鼠脊髓損傷后運動功能恢復的影響以及其主要可能的機制。
　　實驗一: GET-1純合子小鼠的篩選和野生型小鼠脊髓損傷后運動功能恢復的差異
　　本部

5、分實驗首先篩選出GET-1純合子小鼠。由于本實驗用的GET-1轉基因小鼠無法確定外源基因片段在染色體上的定位,因此要想獲得GET-1純合子小鼠,只有通過交配策略,來獲得GET-1純合子小鼠。所以我們首先將PCR檢測為陽性的兩只半合子GET-1小鼠交配,然后將其后代中PCR鑒定為陽性的后代同胞之間進行交配,再將這一代PCR鑒定為陽性的GET-1轉基因小鼠與野生型小鼠交配產生后代,如果后代全部為GET-1PCR鑒定為陽性小鼠則可確定其父/母

6、代GET-1小鼠為GET-1純合子小鼠。篩選出純合子GE T-1轉基因小鼠后與野生型小鼠一起建立脊髓夾傷模型,通過BMS小鼠運動功能學評分顯示:GET-1小鼠在脊髓損傷后其運動功能恢復不如野生型小鼠運動恢復的好。然后我們觀察統(tǒng)計了兩種小鼠在脊髓損傷后的7d和14d損傷面積的大小,結果顯示GET-1轉基因小鼠的損傷面積大于WT小鼠的損傷面積。本部分實驗表明內皮素1(ET-1)在星形膠質細胞過表達后可能作用與某些機制,抑制了小鼠脊髓損傷后神

7、經元的再生或者在脊髓損傷后造成了更加嚴重的脊髓組織的破壞。
　　實驗二:內皮素1在星形膠質細胞過表達后對小鼠脊髓損傷后血脊髓屏障的影響
　　本部分實驗我們主要研究的是內皮素1(ET-1)在星形膠質細胞過表達后是造成怎樣的損傷機制來影響小鼠脊髓損傷后運動功能的恢復。首先我們檢測了內皮素1(ET-1)在脊髓損傷后1d、3d、7d、14d在GET-1轉基因小鼠和野生型小鼠的表達情況,結果顯示在脊髓損傷后3d時野生型小鼠內皮素1的表

8、達首先下降,然后上升,但是仍然低于沒有脊髓損傷的正常生理條件的表達,而GET-1轉基因小鼠在脊髓隨損傷后內皮素1(ET-1)的表達有了一定程度的下調,這可能是由于脊髓損傷后血管結構的破壞造成的。隨后我們進行血脊髓屏障破壞程度的檢測。通常情況下小鼠脊髓損傷后血脊髓屏障的破壞主要出現(xiàn)在損傷后的24h之內,我們在GET-1轉基因小鼠和野生型小鼠脊髓損傷24h后通過小鼠尾靜脈灌注Eva ns b lue,30 min后取冰凍切片直接觀察到GET

9、-1轉基因小鼠在脊髓損傷24h時,Eva ns blue在脊髓損傷部位的滲出量遠遠高于野生小鼠的滲出量,通過用酶標儀測定脊髓損傷中心兩端0.5c m組織中Evans blue的滲出量,統(tǒng)計結果印證了前面觀察到的結果。本部分實驗證明內皮素1(ET-1)在星形膠質細胞過表達后嚴重影響了小鼠脊髓損傷后血脊髓屏障的完整性,進而可能造成了兩種小鼠脊髓損傷后運動學功能恢復的差異
　　實驗三:內皮素1在星形膠質過表達對小鼠脊髓損傷后損傷中心附近