糖皮質(zhì)激素通過快速非基因組機(jī)制抑制中性粒細(xì)胞性炎癥及提高急性應(yīng)激耐受力.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體分子及其人工合成類似物，它對(duì)機(jī)體的發(fā)育、生長、代謝以及免疫功能等起著重要調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的樞紐，在應(yīng)激反應(yīng)和應(yīng)激損傷中起關(guān)鍵性作用，也是臨床上使用廣泛而療效顯著的抗炎、抗過敏和免疫抑制劑。GCs除經(jīng)典的基因組機(jī)制外，還存在著非基因組作用機(jī)制。
　　 GCs非基因組機(jī)制常見于討論大劑量沖擊療法的作用機(jī)制。在GCs大劑量沖擊療法時(shí)，GCs劑量遠(yuǎn)高

2、于飽和體內(nèi)所有GCs受體(glucocorticoidsreceptor，GCR)所需要的濃度，對(duì)此基因組機(jī)制是無法解釋的。但是GCs非基因組機(jī)制的分子作用靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究揭示。糖皮質(zhì)激素大劑量沖擊療法是急性肺損傷、急性脊髓損傷、COPD、急性活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等眾多急重癥的特效治療方法。這些GCs大劑量沖擊療法的適應(yīng)癥中多數(shù)病理表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞(neutrophil，又稱多形核白細(xì)胞，polymorphonuclearleuk

3、ocyte，PMN)性炎癥損傷，顧名思義，其主要炎癥細(xì)胞為PMN。PMN是非常關(guān)鍵的固有免疫細(xì)胞，從其數(shù)量占人外周血白細(xì)胞總數(shù)的50～70％可見一斑。細(xì)菌、病毒、異物等多種刺激均可以活化PMN?；罨腜MN是一把雙刃劍，它通過吞噬、脫顆粒、呼吸爆發(fā)及分泌促炎細(xì)胞因子，既參與機(jī)體防御功能和免疫反應(yīng)，同時(shí)又可帶來組織的繼發(fā)性損傷，是多種疾病的主要炎癥細(xì)胞。因而，GCs對(duì)PMN作用的研究一直受到廣泛的重視。我們課題組前期研究表明大劑量GCs具

4、有快速抑制PMN脫顆粒的效應(yīng)，而抑制磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase4，PDE4)可能是其作用機(jī)制之一。本課題研究第一部分在此基礎(chǔ)上，以中性粒細(xì)胞(neutrophils，PMN)為研究對(duì)象，建立了在體和離體炎癥模型，以求在整體動(dòng)物炎癥模型證明GCs大劑量沖擊療法中存在非基因組作用；以偶聯(lián)氨基酸新型GCs進(jìn)一步驗(yàn)證GCs快速抑制PMN脫顆粒為非基因組效應(yīng)；并通過研究胞內(nèi)游離鈣離子([Ca2+]i)、胞膜流動(dòng)性、胞膜脂筏等

5、關(guān)鍵靶點(diǎn)，以其進(jìn)一步闡明GCs抑制中性粒細(xì)胞性炎癥的非基因組分子機(jī)制。
　　 GCs非基因組機(jī)制的臨床意義日趨明朗并逐漸被接受，但機(jī)體這一與生俱來的重要的調(diào)節(jié)機(jī)制不可能僅為臨床用藥準(zhǔn)備著，必然有其重要的生理調(diào)節(jié)意義。目前，學(xué)術(shù)界公認(rèn)GCs通過基因組機(jī)制發(fā)揮作用的時(shí)間一般至少需要30分鐘。故認(rèn)為在急性應(yīng)激起始階段交感-腎上腺髓質(zhì)軸發(fā)揮著重要作用，交感-腎上腺髓質(zhì)在應(yīng)激時(shí)快速分泌兒茶酚胺，具有興奮心血管、呼吸系統(tǒng)、升高血糖等防御代償

6、意義。而許多急性應(yīng)激反應(yīng)的初始階段即有大量糖皮質(zhì)激素分泌，并有多種生理生化指標(biāo)產(chǎn)生快速改變。GCs分泌增多是應(yīng)激反應(yīng)中最重要的環(huán)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，摘除雙側(cè)腎上腺的動(dòng)物只能在沒有應(yīng)激的狀態(tài)下生存，輕微的有害刺激即可導(dǎo)致其死亡。但如僅去除腎上腺髓質(zhì)而保留腎上腺皮質(zhì)，則動(dòng)物的生存能力增強(qiáng)。給摘除腎上腺的動(dòng)物注射GCs，可使動(dòng)物恢復(fù)抗損傷的能力。可見，機(jī)體調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)離不開GCs，故我們推測(cè)急性應(yīng)激早期即有GCs非基因組機(jī)制參與調(diào)節(jié)，但是目前還

7、缺乏有力實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，在本課題的第一部分，我們以去腎上腺小鼠急性負(fù)荷強(qiáng)迫游泳(AcuteWeight-LoadedForcedSwimming，AWLFS)力竭應(yīng)激模型，觀察應(yīng)激劑量GCs對(duì)小鼠游泳力竭時(shí)間的快速調(diào)節(jié)作用，并應(yīng)用GCs核受體拮抗劑RU486排除經(jīng)典基因組機(jī)制調(diào)節(jié)作用。在組織器官水平，應(yīng)用病理切片HE染色和電鏡檢測(cè)了GCs對(duì)主要靶器官骨骼肌力竭損傷的快速保護(hù)作用。檢測(cè)血糖、血乳酸、NO、骨骼肌ATP等重要生理和生化指標(biāo)。

8、在細(xì)胞水平，利用小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞株分化成肌管細(xì)胞，以ACh刺激肌管細(xì)胞強(qiáng)直收縮模擬力竭運(yùn)動(dòng)，檢測(cè)GCs對(duì)肌管細(xì)胞葡萄糖攝取、NO合成釋放的影響。探索GCs在調(diào)節(jié)急性應(yīng)激反應(yīng)中的非基因組作用及其初步分子機(jī)制。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 一、糖皮質(zhì)激素通過快速非基因組機(jī)制抑制中性粒細(xì)胞性炎癥：
　　 1.大劑量甲強(qiáng)龍(0.04mg/gbodywti.v.)抑制了甲酰三肽(N-formyl-methion

9、yl-leucyl-phenylalanine，fMLP)引發(fā)的小鼠急性全身性炎癥反應(yīng)血漿MPO、乳鐵蛋白等中性粒細(xì)胞脫顆粒源性炎性介質(zhì)釋放。
　　 2.偶聯(lián)氨基酸新型GCs可在其作用10分鐘內(nèi)抑制PMN脫顆粒。
　　 3.大劑量GCs在15分鐘內(nèi)對(duì)PMN無細(xì)胞毒性作用，反而具有保護(hù)作用。
　　 4.GCs加快fMLP激發(fā)的PMN[Ca2+]i升高快速恢復(fù)正常，并且不能被RU486、CHX阻斷。
　　 5

10、.甲強(qiáng)龍(104-4～10-5M)，fMLP自身均具有快速升高PMN胞膜熒光偏振度，降低PMN胞膜流動(dòng)性的作用。MP與fMLP同時(shí)作用下，PMN微黏度較兩者中任何一個(gè)單獨(dú)作用都顯著降低。
　　 6.甲強(qiáng)龍及偶聯(lián)BSA的皮質(zhì)酮預(yù)處理可抑制fMLP引發(fā)的PMN胞膜脂筏呈多點(diǎn)聚集現(xiàn)象，RU486、CHX均不能阻斷這一效應(yīng)，但是以MβCD破壞胞膜脂筏，對(duì)甲強(qiáng)龍抑制PMN脫顆粒效應(yīng)無影響。
　　 二、糖皮質(zhì)激素通過快速非基因組機(jī)制

11、提高急性負(fù)荷強(qiáng)迫游泳力竭應(yīng)激耐受力：
　　 1.利用去腎上腺小鼠急性負(fù)荷游泳力竭應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)GCs在早期(20分鐘內(nèi))即可以顯著延長小鼠的游泳力竭時(shí)間，而GCs受體拮抗劑RU486不能阻斷GCs的這一早期效應(yīng)。
　　 2.在組織器官水平，組織病理觀察：HE染色結(jié)果顯示負(fù)荷游泳力竭小鼠骨骼肌部分肌纖維斷裂、溶解，GCs能夠在作用20分鐘內(nèi)減輕充血和肌纖維的損傷。電鏡觀察到負(fù)荷游泳力竭小鼠腓腸肌肌原纖維部分溶解、肌漿網(wǎng)空泡

12、化，部分M線及Z線模糊消失、線粒體固縮、密度增高，而GCs預(yù)處理組損傷不明顯。
　　 3.在整體動(dòng)物水平，GCs快速降低游泳力竭小鼠血漿NO水平，NOS抑制劑L-NAME單獨(dú)或聯(lián)用GCs均可延長小鼠力竭時(shí)間。GCs可快速抑制ACh引起的肌管細(xì)胞NO釋放，RU486不能阻斷。GCs可快速升高力竭游泳小鼠血糖和骨骼肌組織ATP，并不能被RU486阻斷，但在細(xì)胞水平抑制骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取。
　　 結(jié)論：
　　 以上結(jié)

13、果表明：
　　 1.大劑量GCs具有體內(nèi)外快速抑制PMN脫顆粒的非基因組效應(yīng)，可能是GCs治療急性肺損傷、急性脊髓損傷、COPD、RA等許多中性粒細(xì)胞性炎癥性疾病的重要機(jī)制之一；GCs促進(jìn)fMLP激發(fā)的PMN升高快速恢復(fù)，可能是GCs快速抑制PMN脫顆粒的非基因組作用靶點(diǎn)之一；GCs對(duì)PMN胞膜脂筏、膜流動(dòng)性的快速作用并非GCs快速抑制PMN脫顆粒的作用靶點(diǎn)。
　　 2.GCs非基因組機(jī)制存在于急性應(yīng)激反應(yīng)這一生理進(jìn)程中

14、，應(yīng)激時(shí)GCs大量快速分泌具有其非基因組機(jī)制的生理意義；GCs一方面通過快速抑制NO系統(tǒng)過度活化升高骨骼肌組織ATP并解除NO對(duì)肌力的直接或間接抑制，另一方面通過抑制骨骼肌等細(xì)胞攝取葡萄糖快速升高力竭游泳小鼠血糖途徑提高機(jī)體對(duì)急性力竭應(yīng)激反應(yīng)的耐受力。
　　 本研究表明，藥理劑量GCs具有非基因組抗炎效應(yīng)，GCs對(duì)[Ca2+]i外流的調(diào)節(jié)是其可能作用靶點(diǎn)；GCs的生理效應(yīng)中存在防護(hù)應(yīng)激損傷的非基因組調(diào)節(jié)機(jī)制，NO-NOS系統(tǒng)可能