基質細胞衍生因子-1在組織工程修復軟骨損傷時對間充質干細胞募集和促進分化的作用.pdf

1、研究背景：由于關節(jié)軟骨內無血管分布,且軟骨細胞被周圍基質成分所包圍,因此軟骨損傷后通常會發(fā)生不可逆的病理過程,引起關節(jié)功能改變。目前尚無結構、成分、力學性質與正常關節(jié)軟骨類似的再生透明軟骨,關節(jié)軟骨損傷后修復仍是骨科學沒有解決的難題。目前的多種治療力‘法,如微骨折術、自體或異體組織（骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊）移植等,存在種種缺陷從而限制其臨床應用,并且不能獲得滿意的治療效果。應用組織工程技術構建組織工程軟骨或骨軟骨復合體被認為是目前最有可

2、能解決此難題的技術手段。組織工程包括三大因素:種子細胞、支架材料和信號因子。骨髓間充質干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)具有多向分化潛能,已經被證實能夠向骨、軟骨等多種組織分化:由丁.體外培養(yǎng)細胞有失分化的風險,因此動員體內自體BMSCs修復軟骨損傷是治療軟骨損傷的熱點。SDF-1是骨髓基質細胞分泌的一種重要趨化因子,在神經、造血、血管形成、免疫與腫瘤發(fā)生及進展等方面發(fā)揮重要的作用。CXC

3、R4為SDF-1的唯一受體,分布于多種細胞表面的唯‘的特異性受體CXCR4結合。體內研究表明,造血干細胞的歸巢能力與骨髓基質細胞和內皮細胞分泌的SDF-1有關,也與其本身表達CXCR4強弱有關。SDF-1能有效地維持細胞增殖周期,促使更多的細胞進入生長增殖狀態(tài);SDF-I在不同的細胞群體或在不同的環(huán)境中發(fā)揮不同的作用,目前機制還不清楚,尚需要更多研究去證實。所以本研究重點集中于SDF-I能否募集BMSCs并促進BMSCs向軟骨細胞分化。

4、組織T程修復軟骨過程中,支架不僅起著同定和運載細胞的作用,其性質與孔徑也會影響到細胞的性質和功能。目前已有多種支架用于軟骨組織工程來修復軟骨損傷,常用的有聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)、膠原、殼聚糖等。PLGA海綿支架是已被美國食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministrationFDA)批準可用于臨床的醫(yī)用材料。PLGA海綿支架有相互交通的三維空間,為細胞提供了廣闊的生存環(huán)境,而且能

5、夠允許細胞在三維空間中運動和遷移,克服了體外單層培養(yǎng)時的細胞接觸抑制現(xiàn)象;三維空間相互交通,可以允許細胞間進行信息傳遞、營養(yǎng)物質轉運、代謝產物轉運等:同時,細胞和細胞分泌的細胞外基質可以被限制在支架的三維結構巾,有利于新生組織的結構改建和整合。綜上,本實驗欲利用PLGA海棉支架附載SDF-I,募集自體BMSCs,并利用軟骨缺損部位微環(huán)境促進BMSCs向軟骨細胞分化修復軟骨缺損。因此本實驗的研究內容有:第一,體內外驗證SDF-1對BMSC

6、s的趨化效應;第二,驗證利用SDF-1促進BMSCs表達軟骨特征蛋白,II型膠原及糖胺多糖;第三,利用附載SDF-1的PLGA支架修復軟骨缺損,以期為關節(jié)軟骨損傷的治療提供新思路,探索一條新途徑。
　　 方法：(l)分離、培養(yǎng)、并用流式細胞術鑒定BMSCs。(2)利用免疫組化方法驗證SDF-1的特異抗體在BMSCs的分布。(3)體外利用Transwell板檢測SDF-I對BMSCs的趨化效應。(4)體外BrdU標記BMSCs。(

7、5)用附載SDF-1的PLGA支架植入軟骨缺損動物模型中,驗證SDF-I在體內對BMSCs的募集效應。(6)體外不同濃度SDF-I與BMSCs共培養(yǎng),用實時熒光定量PCR(Real-timePCR),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白質印跡法(Westernblotting)檢測BMSCs表達II型膠原及糖胺多糖的情況。(7)將成年雄性新兩蘭大白兔60只,隨機分為4組:GroupD（缺損對照組）、GroupP（PLGA支架）、Grou

8、pSP（SDF-1+PLGA支架）、GroupAP（AMD+PLGA支架）;建立雙膝關節(jié)股骨滑車軟骨缺損模型（直徑4mm,深度3mm）,用附載SDF-I的PLGA支架植修復兔膝關節(jié)軟骨缺損動物模型。術后4W,8W,12W利用國際軟骨修復學會(ICRS)大體和組織學評分驗證各組的修復效果。定量結果用均數(shù)士標準差表示,統(tǒng)計學分析使用SPSS軟件采用Mann-Whitney檢驗,p＜0.05為有統(tǒng)計學意義:組織學ICRS評分結果用中位數(shù)士四分

9、位間距（medians±interquartilerangeM±QR）統(tǒng)計學分析使用秩和檢驗分析數(shù)據(jù),P＜0.008為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)BMSCs,分離培養(yǎng)后采用流式細胞術鑒定BMSC,CD90、CD44呈陽性,而血液米源分子表面標記CD14、CD45呈陰性。免疫組織化學證明,SDF-I的特異性抗體分布于BMSCs表面。體外Transwell趨化實驗表明,隨著SDF-I濃度增加,趨化的細胞數(shù)逐漸增多,

10、當SDF-I濃度為50ng/ml時,遷移細胞數(shù)達峰值。為驗證SDF-1在體內可以募集BMSCs,將BMSCs體外BrdU標記,從靜脈注入軟骨缺損模型,結果發(fā)現(xiàn),當SDF-I的附載濃為50ng/ml時募集的BrdU標記的BMSCs最多。體外SDF-I與BMSCs共培養(yǎng),RT-PCR,ELISA、WESTERN-bloting檢測結果示,SDF-1刺激濃度為50ng/ml時,BMSCs表達II型膠原及糖胺多糖明顯比對照組高。動物實驗結果表明

11、,術后12W,附載SDF-I+PLGA支架組,軟骨表面平整,缺損由透明組織修復,內有大量軟骨細胞,表層細胞平行于表面,深層細胞成柱狀排列,趨于正常,可見軟骨下潮線;與周圍正常軟骨界線消失。甲苯胺藍染色和II型膠原染色均為陽性:ICRS組織學評分結果示,術后4W、8W,SDF-I+PLGA支架組修復效果與裸支架組無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.008）;術后12W,附載SDF-I+PLGA支架組修復效果明顯優(yōu)于裸支架組（P=o.001）;在同一

12、時間點,附載SDF-I+PLGA支架組修復效果優(yōu)于對照組（軟骨缺損組）(P＜0.008)。
　　 結論：(l)SDF-I體內外可募集BMSCs。(2)SDF-1（50ng/ml）與BMSCs共培養(yǎng)后,可促進BMSCs分泌II型膠原及糖胺多糖,有助于BMSCs向軟骨細胞轉化。(3)用附載SDF-1(50ng/ml)的PLGA支架復合體治療軟骨缺損,結果表明,附載SDF-1(50ng/ml)的PLGA支架復合體可以明顯促進軟骨缺損修