膠聯(lián)羊膜治療角膜堿燒傷及深層損傷的實驗研究.pdf

1、目的:觀察膠聯(lián)羊膜治療兔角膜化學(xué)性堿燒傷及深層損傷的效果，探討其促進角膜損傷愈合的機制，為膠聯(lián)羊膜臨床應(yīng)用奠定理論及實驗基礎(chǔ)。 本研究分為3部分： 實驗一：膠聯(lián)羊膜治療角膜堿燒傷的實驗研究 實驗二：膠聯(lián)羊膜治療角膜深層損傷的實驗研究 實驗三：DTAF 標(biāo)記膠聯(lián)羊膜移植轉(zhuǎn)歸的實驗研究 方法： 實驗一：新西蘭大白兔60只，隨機分為3組，A組：單層膠聯(lián)羊膜組；B組：單層普通羊膜組；C組：對照組，

2、每組20只。浸有1mol/1NaOH的圓形濾紙片貼于兔角膜表面，建立重度堿燒傷模型,4-6小時內(nèi)按分組行羊膜覆蓋術(shù)。術(shù)后觀察結(jié)膜充血水腫、羊膜溶解脫落、角膜水腫混濁等情況，并對新生血管、角膜透明度進行評分；熒光素染色照相，計算機圖象分析系統(tǒng)定量測定角膜上皮愈合面積。術(shù)后第7、14、28、42d，每組處死5只動物，取角膜行組織病理學(xué)檢查，免疫組織化學(xué)方法半定量檢測角膜中 TGF-β1、MMP-2的表達。 實驗二：新西蘭大白兔45只

3、，隨機分為3組，A組：雙層膠聯(lián)羊膜組；B組：普通雙層羊膜組；C組：損傷對照組，每組15只。用直徑7.5mm角膜環(huán)鉆在角膜中央劃痕，沿劃痕剔除1/2厚度板層角膜，建立兔角膜深層損傷模型，4小時內(nèi)按分組行羊膜移植術(shù)。術(shù)后觀察羊膜溶解脫落時間、角膜愈合情況、新生血管及角膜透明度。第7、14、28d，每組取5只角膜行組織病理學(xué)檢查，TUNEL 法檢測角膜基質(zhì)凋亡細胞，并計數(shù)PMNS。 實驗三：新西蘭大白兔5只，按實驗二中方法建立角膜深層

4、損傷模型。雙層膠聯(lián)羊膜用0.5％DTAF熒光標(biāo)記后，移植于角膜創(chuàng)面，再在其上覆蓋一層起保護作用的單層羊膜，并縫合固定于淺層鞏膜。術(shù)后每日觀察羊膜及角膜大體情況，第7、15、30、60、90d各處死一只動物，取角膜平分為兩份，一份送透射電鏡檢查，另一份冰凍切片后行激光共聚焦顯微鏡檢查及HE染色組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果: 實驗一： 1．羊膜溶解脫落時間：膠聯(lián)羊膜完全溶解脫落的時間為21.00±2.418d，而普通羊膜為

5、12.20+2.618d，兩種羊膜溶解脫落時間存在顯著差異(P<0.01)。 2．角膜基質(zhì)PMNS浸潤：角膜堿燒傷后各時間點，膠聯(lián)羊膜組角膜基質(zhì)中PMNS明顯少于對照組(P<0.05)，而普通羊膜組僅在堿燒傷后第7、14d較對照組減少(P<0.05)，其它時間點則無顯著差異(P>0.05)。 3．角膜新生血管評分：膠聯(lián)羊膜組角膜新生血管評分平均值在術(shù)后第14、28、42d時，與損傷對照組比較均有顯著差異(P<0.01)，

6、而普通羊膜組雖然低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 4．角膜混濁度評分：膠聯(lián)羊膜組及普通羊膜組角膜混濁度評分平均值在術(shù)后1 4d時均與對照組無顯著差異(PA=0.435,PB=0.196)；膠聯(lián)羊膜組角膜渾濁度評分平均值在術(shù)后第28、42d時明顯低于對照組(P<0.01)，而普通羊膜組僅在術(shù)后第42d時低于對照組(P<0.05)。 5．角膜上皮愈合時間：術(shù)后第14、28、42d時，膠聯(lián)羊膜組及普通羊膜組角膜

7、上皮愈合面積均明顯多于對照組(P<0.05)，但三個時間點，兩羊膜組上皮愈合面積組間差異具有顯著性(P<0.05)。 6．角膜基質(zhì)TGF-β1的表達：膠聯(lián)羊膜組及普通羊膜組在術(shù)后第7、14d時角膜基質(zhì)中TGF-β1的表達均明顯低于對照組(P<0.05)，兩羊膜組組間差異無顯著性(P7=0.523，P14=0.446)。術(shù)后28、42d，膠聯(lián)羊膜組角膜基質(zhì)中TGF-β1的表達明顯低于對照組(P<0.05)，而普通羊膜組與對照組比較

8、，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P28=0.519,P42=0.179)。三個實驗組術(shù)后各時間點角膜基質(zhì)中TGF-β1的表達均較正常角膜明顯增高(P<0.05)。 7．角膜基質(zhì) MMP-2的表達：術(shù)后各時間點三個實驗組角膜基質(zhì)中MMP-2的表達均較正常角膜增高，其中膠聯(lián)羊膜組角膜基質(zhì)中 MMP-2的表達在術(shù)后第7、14、28d時較對照組明顯降低(P<0.05)，而普通羊膜組僅在術(shù)后第7、14d時較對照組低(P<0.05)。兩羊膜移植組間差異

9、具有顯著性(P=0.000)。術(shù)后第42d時，兩羊膜組角膜基質(zhì)中 MMP-2的表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(PA=0.2148,PB=0.4132)。 8．角膜潰瘍穿孔情況：整個觀察期，膠聯(lián)羊膜組無一例角膜發(fā)生穿，而普通羊膜組和對照組分別有2例和3例發(fā)生角膜潰瘍穿孔。 實驗二： 1．膠聯(lián)羊膜移植后可較長時間緊密覆蓋于創(chuàng)面不溶解脫落，而普通雙層羊膜移植后3-5天即出現(xiàn)羊膜層間積液，繼而導(dǎo)致羊膜溶解脫落。

10、 2．膠聯(lián)羊膜組無一例角膜穿孔，角膜全部恢復(fù)正常厚度，保持了一定的透明性，新生血管和瘢痕化程度輕，角膜基質(zhì)中膠原纖維排列整齊。普通雙層羊膜組和對照組分別有3例和2例角膜穿孔，角膜新生血管粗大，瘢痕致密，膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂。 3．膠聯(lián)羊膜組角膜基質(zhì)中凋亡細胞在術(shù)后各觀測時間點均較損傷對照組明顯減少(P<0.05)，而普通雙層羊膜組僅在術(shù)后7d時與損傷對照組存在顯著差異(P<0.05)。術(shù)后7d，膠聯(lián)羊膜組和普通羊膜組角膜基質(zhì)中PM

11、NS數(shù)量均較損傷對照組明顯減少(P<0.05)，兩羊膜移植組間差異具有顯著性(P<0.01)。 實驗三： 1．角膜表面起保護作用的單層羊膜術(shù)后1w內(nèi)基本溶解脫落，暴露出角膜創(chuàng)面嵌合的黃色膠聯(lián)羊膜。隨時間推移，膠聯(lián)羊膜部分溶解，角膜創(chuàng)面逐漸修復(fù)。至術(shù)后30d時，可見角膜創(chuàng)面殘留有局限淺黃色瘢痕，約高出于眼表，通過肉眼和裂隙燈檢查無法準(zhǔn)確判斷其性質(zhì)，但至觀察結(jié)束時，角膜透明度有所提高，眼表光滑，隱約可見此淺黃色痕跡。

12、 2．組織病理學(xué)觀察顯示，術(shù)后7d時，膠聯(lián)羊膜與角膜創(chuàng)面貼合緊密，角膜創(chuàng)緣交界處上皮細胞已分裂為9-13層，表層的扁平上皮細胞沿膠聯(lián)羊膜的上下兩層及中間的纖維蛋白膠移行，部分移行細胞已分裂為2層細胞結(jié)構(gòu)；術(shù)后15d時，纖維蛋白膠已降解，移行的上皮細胞完全將羊膜覆蓋，分裂為2-3層復(fù)層上皮，角膜創(chuàng)面厚度略高于正常角膜，角膜基質(zhì)中成纖維細胞增殖活躍并分泌大量膠原將羊膜基質(zhì)包裹。術(shù)后30d時，角膜厚度基本恢復(fù)正常，上皮細胞完整均勻一致，為5-

13、7層復(fù)層上皮與角膜前基質(zhì)緊密連接。羊膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整清晰，其周圍無巨噬細胞及炎細胞浸潤。至術(shù)后60d和90d時，角膜厚度恢復(fù)正常，上皮細胞完整，前彈力層缺損，基質(zhì)膠原排列整齊，偶見管腔完整的新生血管，角膜基質(zhì)中羊膜結(jié)構(gòu)較前無明顯變化。 3．激光共聚焦顯微鏡觀察到膠聯(lián)羊膜移植后各時間點，角膜基質(zhì)中均可見黃綠色熒光羊膜條帶，其熒光強度及寬度隨時間無明顯變化，周圍角膜基質(zhì)中無黃綠色熒光滲漏。 4．透射電鏡觀察示整合于角膜基質(zhì)中的

14、羊膜及其周圍的角膜基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變，修復(fù)的角膜上皮細胞與基質(zhì)連接緊密，形成橋?；虬霕蛄＿B接。 結(jié)論: 1．對于角膜化學(xué)性堿燒傷，膠聯(lián)羊膜較普通羊膜具有更好的治療效果，它可以明顯延長羊膜在角膜創(chuàng)面的覆蓋時間，抑制堿燒傷后PMNS對角膜基質(zhì)的浸潤，抑制角膜基質(zhì)中TGF-β1及MMP-2的表達，促進上皮愈合，穩(wěn)定眼表。它可以發(fā)揮羊膜及纖維蛋白膠的雙重治療作用，抑制角膜基質(zhì)溶解，防止角膜潰瘍形成或穿孔，抑制堿燒傷后角膜

15、新生血管形成，減輕瘢痕程度，提高角膜透明性。 2．膠聯(lián)羊膜對角膜深層損傷具有較好的治療效果，它不僅可以補充角膜基質(zhì)中破壞的膠原，封閉創(chuàng)面，為角膜上皮提供健康的基底膜，還可以抑制角膜細胞凋亡及PMNS浸潤，減輕新生血管及瘢痕形成。 3．膠聯(lián)羊膜移植于角膜深層創(chuàng)面后，隨時間推移，纖維蛋白膠完全降解，而羊膜卻伴隨著角膜創(chuàng)面修復(fù)包裹于角膜基質(zhì)中，成為角膜結(jié)構(gòu)的一部分。整合于角膜基質(zhì)中的羊膜并不會很快溶解吸收，也不會引起角膜炎癥和