潰結(jié)安抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用機(jī)制研究及其穩(wěn)定性、毒性評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景:
　　潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)為直腸、結(jié)腸的淺表性、非特異性炎癥性消化道疾病。隨著人們生活習(xí)慣及飲食習(xí)慣的改變，該病發(fā)病率逐年升高。UC的病因涉及環(huán)境及遺傳等因素，其病理生理機(jī)制尚未完全明確。目前，潰瘍性結(jié)腸炎的治療缺乏理想藥物。
　　沒(méi)食子具有生干生寒、燥濕收斂、固牙止痛、清熱消炎、祛腐愈傷、涼血止血、止瀉止痢等功效。維吾爾醫(yī)學(xué)實(shí)踐中用沒(méi)食子水提物治療UC具有悠久歷史。西帕依潰結(jié)

2、安灌腸劑(KJA)處方來(lái)自維吾爾醫(yī)名方“西帕依固齦液”，為《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)—維吾爾藥分冊(cè)》1999年版收載品種，僅為沒(méi)食子一味藥制成。
　　基于沒(méi)食子能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)抑制炎癥反應(yīng)，本課題組在治療口腔疾病的西帕依固齦液基礎(chǔ)上，擴(kuò)大適應(yīng)證,經(jīng)過(guò)改進(jìn)工藝、改變給藥途徑，開(kāi)發(fā)出具有維吾爾醫(yī)學(xué)特色KJA，用于治療UC。本課題研究KJA治療UC的作用機(jī)制及其制劑穩(wěn)定性、毒性及毒理學(xué)特征。課題研究結(jié)果將為KJA工業(yè)化生產(chǎn)、運(yùn)輸、

3、儲(chǔ)存及在臨床上安全、有效、合理應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　(1)應(yīng)用UC動(dòng)物模型，從整體、組織、細(xì)胞及分子水平確證KJA治療UC的有效性及作用機(jī)制;
　　(2)開(kāi)展KJA制劑的穩(wěn)定性研究，為制劑工業(yè)化生產(chǎn)、儲(chǔ)存、包裝提供合理質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn);
　　(3)探討KJA制劑的毒性及毒理學(xué)特征，為臨床安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)作用機(jī)理研究:以雄性Wistar大鼠為受試對(duì)象，2、4-二硝

4、基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）復(fù)合乙酸法誘導(dǎo)UC模型為造模方法，KJA為受試藥物，設(shè)立6組，正常對(duì)照組、UC模型陰性對(duì)照組、陽(yáng)性藥美沙拉秦緩釋顆粒劑（5-ASA）對(duì)照組、5-ASA加KJA灌腸綜合治療組、KJA灌胃組、KJA灌腸組。分別設(shè)立10天、6天、6天，共三個(gè)療程。檢測(cè)體征、體重、進(jìn)食量及飲水量等一般指標(biāo);組織病理觀察結(jié)腸黏膜大體形態(tài)及評(píng)分;提取結(jié)腸組織細(xì)胞檢測(cè)凋亡率;高通量篩選血漿差異表達(dá)蛋

5、白;LC-MS檢測(cè)血漿中沒(méi)食子酸濃度。
　　(2)穩(wěn)定性評(píng)價(jià):以顏色、pH值、離心前后總酚含量、離心前后鞣質(zhì)含量、沉淀量為指標(biāo)，對(duì)開(kāi)口及包裝KJA分別進(jìn)行60℃、40℃條件下、強(qiáng)光條件下影響因素試驗(yàn);對(duì)包裝KJA進(jìn)行加速試驗(yàn)和常溫、4℃條件下長(zhǎng)期試驗(yàn)(常溫試驗(yàn)增加薄層色譜法(TLC)定性鑒別沒(méi)食子酸指標(biāo)）;以總酚、鞣質(zhì)含量為指標(biāo)對(duì)KJA進(jìn)行經(jīng)典恒溫法預(yù)測(cè)有效期。
　　(3)毒性及毒理學(xué)評(píng)價(jià):在ICR品系雌、雄小鼠進(jìn)行急性毒性

6、及最大耐受量測(cè)定試驗(yàn);在雄性新西蘭兔進(jìn)行局部結(jié)腸黏膜刺激性試驗(yàn);在雌、雄Wistar大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。確定灌腸給藥體積:小鼠10mL/kg，大鼠5mL/kg，兔子2.5mL/kg;體表系數(shù)法換算確定灌腸低、中、高劑量生藥量:小鼠分別為5.0g/kg、7.4g/1kg、10g/kg，大鼠分別為0.2g/kg、0.8g/1kg、2g/kg，兔子分別為0.1g/kg、0.95g/kg。
　　結(jié)果:
　　(1) KJA對(duì)大鼠UC

7、的治療作用:
　　①KJA灌腸給藥顯著降低DNCB復(fù)合乙酸法誘導(dǎo)UC模型大鼠體重減輕癥狀，改善飲食及飲水量;
　　②結(jié)腸組織大體評(píng)分顯示KJA灌腸給藥作用優(yōu)于KJA灌胃給藥;
　?、劢Y(jié)腸組織大體評(píng)分提示KJA和5-ASA聯(lián)合使用療效更好;
　　④組織病理學(xué)評(píng)分顯示KJA灌腸組與5-ASA組均能減輕結(jié)腸組織損傷，促進(jìn)UC結(jié)腸病變組織修復(fù)，組間無(wú)差異;
　?、軰JA灌胃、灌腸給藥可縮小胰腺、脾臟系數(shù);
　

8、?、轐JA灌胃、灌腸給藥顯著降低結(jié)腸細(xì)胞凋亡率，KJA灌腸組作用更顯著;
　?、哐獫{蛋白差異性表達(dá)確立:相對(duì)正常組，UC模型組C4bpa上調(diào)、IgG-2a和Igh-6 protein(Fragment)下調(diào);相對(duì)KJA灌腸組，UC模型組Serpina3k上調(diào)、Igh-6 protein下調(diào);
　　⑧灌胃、灌腸給藥24小時(shí)后各組血漿樣品中未檢測(cè)到?jīng)]食子酸，提示無(wú)藥物蓄積。
　　(2) KJA穩(wěn)定性評(píng)價(jià):
　　①加速

9、試驗(yàn)顯示，質(zhì)量穩(wěn)定、有效期暫定2年，長(zhǎng)期試驗(yàn)顯示常溫有效期2年，4℃有效期3年;
　?、诟邷睾蛷?qiáng)光可降低KJA制劑穩(wěn)定性;
　　③長(zhǎng)期試驗(yàn)4℃條件下穩(wěn)定性優(yōu)于常溫條件;
　?、軝z測(cè)指標(biāo)pH值、總酚、鞣質(zhì)、沉點(diǎn)量在個(gè)別觀察時(shí)間點(diǎn)，組間雖有顯著差異(P＜0.05)，但均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi);
　?、菖c開(kāi)口劑型相比，包裝后物理穩(wěn)定性提高;
　?、藿?jīng)典恒溫法預(yù)測(cè)有效期，25℃條件下以總酚為指標(biāo)1.4年、鞣質(zhì)為指標(biāo)0

10、.57年;4℃條件下總酚為指標(biāo)14年、鞣質(zhì)為指標(biāo)32年。
　　(3) KJA毒性及毒理學(xué)特征評(píng)價(jià):急性毒性試驗(yàn)顯示:
　?、僮畲篌w積10mL/kg、最大劑量10g/kg KJA灌腸小鼠無(wú)死亡;
　?、谧畲竽褪芰?MTD)大于10g/kg;
　?、跰TD試驗(yàn)病理切片結(jié)果顯示:與溶媒組相比，KJA高劑量組顯著抑制kupffer細(xì)胞增生，顯著促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞水腫，顯著抑制腸黏膜上皮增生;
　　局部黏膜刺激性試驗(yàn)

11、顯示:給藥14天動(dòng)物無(wú)異常表現(xiàn)，經(jīng)解剖未見(jiàn)與藥物刺激性有關(guān)的肛門(mén)及結(jié)腸黏膜充血、紅腫等現(xiàn)象和組織病理學(xué)變化;
　　長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)顯示:與正常組相比，在KJA低、中、高劑量組給藥3、6個(gè)月及恢復(fù)期1個(gè)月末，MCV、MCHC、T-BIL及AST指標(biāo)有顯著影響，但未呈現(xiàn)與給藥劑量和時(shí)間長(zhǎng)短的關(guān)聯(lián)性，且各指標(biāo)均在正常參考值范圍。
　　結(jié)論:
　　(1)作用機(jī)理研究:
　?、貹JA治療顯著改善UC腸黏膜損傷;
　?、贙

12、JA治療UC可能與緩解炎癥及免疫機(jī)制相關(guān)，涉及C4bpa、Igh-6、Serpina3k和IgG-2a等蛋白。
　　(2)穩(wěn)定性評(píng)價(jià):
　　①常規(guī)評(píng)價(jià)法和經(jīng)典恒溫法均確證KJA灌腸制劑質(zhì)量穩(wěn)定，各成分的有效期均符合制劑標(biāo)準(zhǔn);
　　②強(qiáng)光、高溫能影響KJA物理化學(xué)穩(wěn)定性;
　　③包裝材料可提高制劑物理穩(wěn)定性。
　　(3)毒性及毒理學(xué)特征評(píng)價(jià):
　　①KJA灌腸制劑無(wú)急性毒性作用，MTD大于成人用藥量30