2-吡咯烷酮衍生物HL-5201促人HepG-2細胞增殖和抗凋亡作用的研究.pdf

1、目的:
　　本論文擬通過研究2-吡咯烷酮衍生物HL-5201對人HepG-2增殖及凋亡的影響探討該類化合物的促細胞增殖作用機制。其最終目的是闡明該類化合物的作用靶點，利用該靶點可開發(fā)抗腫瘤藥物，或開發(fā)治療代謝緩慢等相關疾病的藥物，并為該類藥物的安全使用提供理論和實驗依據。
　　方法:
　　本研究采用MTT法檢測了HL-5201體外對多種細胞株的促增殖作用，包括人HepG-2、人Hela、人EC109、人MDA-MB-2

2、31、人HGC-27、人PC-3、小鼠RAW264.7、小鼠脾細胞、小鼠BV-2、小鼠C17.2及大鼠PC-12細胞株;觀察HL-5201對幼齡小鼠體重的影響，研究HL-5201是否影響生長發(fā)育;MTT比色法探討不同時間和不同濃度HL-5201對人HepG-2增殖及凋亡的影響;倒置顯微鏡觀察藥物作用后人HepG-2細胞形態(tài)學的改變;DAPI染色后熒光顯微鏡觀察藥物作用后人HepG-2細胞核形態(tài)學的變化。利用PI染色流式細胞儀觀察藥物作用

3、后人HepG-2細胞周期分布的變化;應用JC-1染色法檢測藥物作用后細胞線粒體膜電位的變化。使用Western blotting免疫印跡分析方法和Caspase-3，-9酶活性檢測試劑盒方法檢測藥物作用后細胞增殖和凋亡通路相關蛋白表達及酶活性表達的變化;借助通道抑制劑初步探討HL-5201作用環(huán)節(jié);通過MTT比色法檢測HL-5201結構類似物對人HepG-2增殖和凋亡活性的影響。
　　結果:
　　1)HL-5201對人Hep

4、G-2、人Hela、人EC109有明顯的促增殖作用，但不同細胞作用強度不同;對人HGC-27、人PC-3、小鼠C17.2及大鼠PC-12表現為抑制增殖的作用，且其抑制作用具有濃度依賴性，HL-5201的濃度越大，抑制增殖的活性越強;而對于人MDA-MB-231、小鼠脾細胞、小鼠RAW264.7、小鼠BV-2則表現為雙向作用，在濃度較高時，表現為抑制增殖作用，低濃度時則表現為促進增殖的活性。
　　2) HL-5201對幼齡小鼠各階段

5、體質量增重影響的結果顯示，HL-5201僅在第1～5 d，以50 mg/kg劑量灌胃給藥時能提高小鼠的平均日增重，增重率為7.8％，與空白對照組比較有顯著性差異（P=0.016），其余劑量與時間段對小鼠的平均日增重均無影響(P＞0.05)。
　　3) HL-5201對人HepG-2細胞株具有明顯的促進增殖作用及拮抗MMC的細胞毒作用，且促增殖和拮抗作用的最適作用濃度為45μmol/L，最適作用時間為72 h。
　　4)倒置顯

6、微鏡下我們觀察到空白對照組以及HL-5201組的細胞生長狀況良好，細胞伸展呈梭型及多角形，細胞透亮，生長旺盛。經細胞計數后，HL-5201組的細胞數量要比空白對照組多，說明HL-5201具有促進細胞增殖的作用。而人HepG-2經絲裂霉素C(MMC)作用之后，倒置顯微鏡下可觀察到細胞變圓，貼壁不牢固，有大量漂浮細胞，生長受到明顯的抑制等現象。MMC+HL-5201組在倒置顯微鏡下可見細胞生長狀況明顯改善。經過細胞計數后，MMC+HL-52

7、01組細胞的總數明顯比MMC模型組多，而凋亡細胞數量比MMC組少。說明HL-5201能夠抑制MMC對人HepG-2誘導凋亡的作用。
　　5)經DAPI染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到空白對照組和HL-5201組的細胞核形態(tài)呈圓形，邊緣清晰，染色均勻呈淡藍色，細胞成片生長。HL-5201組的完整細胞核的數量明顯多于空白對照組。MMC模型組經DAPI染色后，從熒光強度以及核形態(tài)可以鑒別出細胞發(fā)生凋亡的典型特征——細胞核固縮，染色質致密呈

8、斑塊狀濃集于核膜下，可見明顯的凋亡小體。MMC和HL-5201共同作用于人HepG-2，在熒光顯微鏡下雖然也能觀察到很多凋亡小體，但MMC+HL-5201組完整細胞核的數量明顯多于MMC凋亡組，而凋亡小體則明顯少于MMC凋亡組。由此說明HL-5201能夠通過促進細胞增殖以及抑制細胞凋亡的途徑以達到增加細胞數量，延長生存時間的目的。
　　6)我們通過PI染色流式細胞儀觀察，發(fā)現HL-5201作用于人HepG-2細胞株后，其對細胞周期

9、分布的影響不明顯，只觀察到與MMC模型組比較，MMC+HL-5201組的亞二倍體細胞數（凋亡細胞）下降4.7％，有統(tǒng)計學意義（P=0.045），其余相同細胞周期的細胞百分率兩兩比較，均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　7)從JC-1染色結果中我們可以觀察到MMC組的HepG-2細胞經MMC作用之后線粒體膜電位下降，并且與空白對照組相比有顯著性差異(P=0.000)。而經HL-5201作用后，我們可發(fā)現HL-5201除了能穩(wěn)定正

10、常的線粒體膜電位之外，還能穩(wěn)定被MMC損傷的線粒體膜電位，提示其可抑制線粒體凋亡途徑的開啟，從而關閉后續(xù)的凋亡反應。
　　8)Western blotting實驗結果表明，與空白對照組相比，HL-5201組的Phospho-Akt(Ser473)、Phospho-Bcl-2(Ser70)、Phospho-Bad(Ser112)蛋白的含量明顯增加，Bad、Bax的表達則明顯減少，對Akt、Bcl-2以及線粒體內部的Cytochrom

11、e C蛋白表達無明顯影響。而當HL-5201與MMC合用后，與MMC模型組相比，HL-5201亦能明顯上調Phospho-Akt(Ser473)、Phospho-Bcl-2(Ser70)、Phospho-Bad(Ser112)的水平，下調Bad、Bax的表達，以及將Cytochrome C蛋白穩(wěn)定在線粒體內部。因此可以認為HL-5201通過調節(jié)上述蛋白基因的表達以及磷酸化，從而促進細胞的增殖分裂并拮抗MMC對人HepG-2細胞誘導的凋亡

12、作用。
　　9) Caspase-3和Caspase-9活性檢測結果顯示，MMC明顯提高兩者的活性，HL-5201作用于MMC誘導的HepG-2凋亡模型后，Caspase-9的活性由9.55U下調為7.12U，有顯著性差異(P=0.000)，Caspase-3的的活性由8.64 U，下調為6.59 U，有顯著性差異(P=0.009)。提示HL-5201可能通過抑制Caspase-3酶原及Caspase-9酶原的活化，進而抑制MMC

13、誘導人HepG-2細胞的凋亡。
　　10) MTT比色法檢測信號通路阻斷劑、蛋白酶或基因轉錄抑制劑對HL-5201作用于人HepG-2代謝活力變化的結果顯示，與空白對照組相比，HL-5201對人HepG-2細胞的代謝活力或增殖具有明顯的促進作用(P=0.000)。酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein、PI3K抑制劑LY294002和Wortmannin、PKA抑制劑H89、MAPKK抑制劑PD98059和U0126、p38MAP

14、K抑制劑SB203580、JAK-2抑制劑AG490、JNK抑制劑SP600125、蛋白酶體抑制劑MG132、基因轉錄抑制劑Actinomycin D均能明顯抑制HL-5201促進HepG-2細胞代謝活力，與HL-5201組比較均有顯著性差異(P值均等于0.000);而NF-κB抑制劑BAY11-7082對HL-5201促進HepG-2細胞代謝活力無影響(P=0.220)。
　　11) MTT比色檢測HL-5201(5s)結構類似

15、物對HepG-2增殖代謝活力及拮抗MMC細胞毒作用實驗結果顯示HL-5201(5s)、5b、5m、5n四個化合物對人HepG-2具有促增殖作用，但作用強度有差異。其中，4個化合物中5b在濃度為90μmol/L時對HepG-2促增殖效果最好，增殖率為44.91％。5n在濃度為60μmol/L對HepG-2促增殖作用具有統(tǒng)計學意義，但增殖效應僅為3.36％。5s、5b、5m對MMC所致人HepG-2的細胞毒性作用具有不同程度的拮抗作用。其中

16、45μmol/L的HL-5201(5s)對MMC的拮抗作用最好，達19.81％;5b僅濃度為90μmol/L具有拮抗MMC的作用，當5b濃度下降到60μmol/L或以下，不僅拮抗效應消失，同時還能與MMC產生協(xié)同作用，促進HepG-2死亡。5n不具有拮抗MMC的作用。
　　結論:
　　1) HL-5201體外對不同的細胞表現的作用效果不同，有些表現為促進增殖，有些表現為抑制增殖，還有一些呈現雙向作用，高濃度抑制，低濃度促進。

17、
　　2)HL-5201體外促細胞增殖作用具有選擇性，不同細胞對HL-5201的敏感性不同。
　　3)HL-5201對幼齡小鼠早期的生長有促進作用，但不會影響最終的發(fā)育與成熟。
　　4)HL-5201能夠促進人HepG-2細胞的增殖，同時能抑制MMC誘導人HepG-2細胞凋亡的作用。
　　5)HL-5201(5s)的結構類似物體外對人HepG-2也具有促增殖和抑凋亡的活性，其活性受取代基的影響。
　　6)綜