溴化乙錠誘導(dǎo)無線粒體DNA乳腺癌T47D細胞系的建立及其細胞生物學特征和超微結(jié)構(gòu)的改變.pdf

1、　　本實驗利用低劑量EtBr(50ng/ml)抑制mtDNA復(fù)制的方法，嘗試篩選并建立一株不含mtDNA的乳腺癌T47Dρ0細胞系，并探討它在生長特征、細胞周期、早期凋亡和超微結(jié)構(gòu)等方面與對照T47D細胞的差別。研究主要分為如下兩大部分：　　第一部分：采用經(jīng)典的低劑量EtBr抑制mtDNA復(fù)制的方法，在補充外源性的尿嘧啶和丙酮酸鈉的條件下，經(jīng)約32天的特殊培養(yǎng)后，分離并篩選無mtDNA的人乳腺癌T47Dρ0細胞。并經(jīng)過DotBlot、

2、real-timePCR和選擇性培養(yǎng)基等方法反復(fù)鑒定后，確認該細胞株內(nèi)mtDNA缺失并具有ρ0細胞共有的營養(yǎng)依賴型體外生長特性。該細胞能在含尿嘧啶、丙酮酸鈉和15％的Gibco胎牛血清環(huán)境中連續(xù)傳代、穩(wěn)定生長?！　〉诙糠郑翰捎蔑@微鏡形態(tài)學、MTT法繪制生長曲線、體外克隆形成實驗和PI細胞周期等實驗對T47Dρ0細胞的生長動力學特征進行分析，發(fā)現(xiàn)T47Dρ0細胞較對照組T47D細胞的形態(tài)略小、皺縮，分裂相少，生長繁殖能力更緩慢，G0-

3、G1期細胞比例上升、S期細胞的比例下降，出現(xiàn)G1-S期阻滯現(xiàn)象。利用流式細胞術(shù)檢測(AnnexinV和rhodamine123)分析mtDNA缺失和細胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果顯示檢測雖然T47Dρ0細胞的線粒體跨膜電位較正常有明顯的下降，但mtDNA缺失并不能大幅度引起細胞早期凋亡的發(fā)生。透視電鏡檢測還發(fā)現(xiàn)，T47Dρ0細胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，主要表現(xiàn)為正常嵴及內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)部分或大范圍的溶解，線粒體自身的腫脹或髓磷體樣改變以及基質(zhì)的電子