AcMNPV敏感宿主Spodoptera frugiperda若干免疫及表觀遺傳相關(guān)基因的研究.pdf

1、桿狀病毒科的成員是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物的雙鏈DNA病毒。其中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multicapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)為桿狀病毒的模式種。由于桿狀病毒對(duì)宿主昆蟲具有高度的致病性，對(duì)非靶標(biāo)生物沒有感染性，生物安全性高，不污染環(huán)境，害蟲不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，世界上已有數(shù)十種桿狀病毒成功用于防治農(nóng)、林、牧業(yè)等相關(guān)害蟲。然而桿狀病毒作為生物殺蟲劑

2、也存在一些缺點(diǎn)，限制了它們的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。安全、有效地應(yīng)用桿狀病毒取決于對(duì)病毒的生物學(xué)、與宿主的相互作用的深入認(rèn)識(shí)。自從1994年AcMNPV全基因組測(cè)序工作完成以來，已經(jīng)有很多必需基因的功能被闡釋，然而對(duì)其與宿主相互作用之間關(guān)系的研究大多仍停留在分子生物學(xué)水平階段。桿狀病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中與其昆蟲宿主建立了嚴(yán)格的寄生關(guān)系，兩者間相互作用、相互適應(yīng)，這種作用是發(fā)生在多層次、多水平上的。我們?cè)O(shè)想從免疫學(xué)和表觀遺傳學(xué)這兩部分入手，探尋T

3、oll信號(hào)通路、DNA甲基化和microRNA三個(gè)方面在病毒與宿主之間相互關(guān)系中所起的作用。
　　Toll蛋白最早發(fā)現(xiàn)參與果蠅背腹極性的形成，后來發(fā)現(xiàn)Toll信號(hào)通路也可以被微生物感染所激活，參與天然免疫應(yīng)答。為了AcMNPV的宿主昆蟲草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中探尋Toll信號(hào)通路，我們分別克隆了編碼Toll的同源蛋白18-wheeler、Toll的體外接頭蛋白Sp(a)tzle以及Toll的胞內(nèi)配

4、體MyD88的基因。18-wheeler編碼一個(gè)1274個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白與家蠶和果蠅中的同源類似物的相似度分別達(dá)56％和44％。Sp(a)tzle是一個(gè)編碼253個(gè)氨基酸的蛋白，與煙草天蛾中的兩個(gè)同源蛋白相似度分別為50％和52％。通過蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)在Sp(a)tzle無活性的前體中也有一個(gè)非常保守的蛋白酶切位點(diǎn)，可以通過該位點(diǎn)被切割形成有活性的成熟體?？寺〉玫降腗yD88經(jīng)過結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)和該家族其他成員一樣，都含

5、有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域和一個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域。這些信息說明S.frugpiperda中的Toll信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白都具有一定的保守性，推測(cè)它們應(yīng)該有著非常重要的功能。這些基因在AcMNPV的敏感細(xì)胞系Sf9細(xì)胞中都得到了表達(dá)。我們?cè)谛奔y夜蛾幼蟲體內(nèi)用各種不同的微生物或其代表分子刺激后發(fā)現(xiàn)，18-wheeler和Sp(a)tzle可以特異性地被金黃色葡萄球菌激活，在脂肪體和中腸內(nèi)都有表達(dá)。同時(shí)，被激活的還有一種證明有抗AcMNPV病毒活性的抗菌肽G

6、loverin。當(dāng)我們提取被金黃色葡萄球菌免疫刺激后的斜紋夜蛾幼蟲血淋巴孵育Sf9也觀察到了同樣的效果。然而當(dāng)我們?cè)噲D在Sf9細(xì)胞中過表達(dá)這三個(gè)蛋白的任何一種或者兩兩組合來模擬天然感染狀態(tài)時(shí)，卻沒有觀測(cè)到Gloverin的提高，因此推測(cè)Sf9細(xì)胞作為非免疫組織來源細(xì)胞在長(zhǎng)期的離體培養(yǎng)過程中失去了一定的免疫功能導(dǎo)致Toll信號(hào)通路不能被激活，所以也無法誘導(dǎo)Gloverin表達(dá)的升高，為AcMNPV的入侵和復(fù)制創(chuàng)造了有利的條件。
　　

7、DNA甲基化是一個(gè)非常重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，它在高等真核生物中被認(rèn)為是沉默基因表達(dá)的重要調(diào)控工具之一。這種修飾是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)完成的。真核生物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要有三類:DNMT1、DNMT2、DNMT3。其中DNMT2家族有著非常保守的序列特征然而對(duì)于其功能卻不甚明了。前期研究表明，AcMNPV在復(fù)制過程中，病毒DNA的甲基化水平呈一定的規(guī)律性變化，而其中的機(jī)制及其與病毒復(fù)制的關(guān)系還不清楚。為了深入探討這一問題，我們

8、從Sf9細(xì)胞中克隆出了編碼DNMT2的基因。該酶與其他家族成員一樣有著非常保守的序列，它均勻分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，體外酶活實(shí)驗(yàn)證明它有能催化DNA甲基化。我們還解析出了DNMT2與其輔酶SAH的晶體結(jié)構(gòu)，和人DNMT2的結(jié)構(gòu)一樣，它包含一個(gè)催化區(qū)、一個(gè)底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域和一個(gè)催化環(huán)。結(jié)合的SAH與周圍的氨基酸有非常強(qiáng)烈的相互作用，催化環(huán)和底物識(shí)別區(qū)域一起形成一個(gè)狹長(zhǎng)的通往SAH結(jié)合位點(diǎn)的通道，可以用來結(jié)合和催化底物。這些結(jié)果暗示在昆蟲中D

9、NMT2也是以經(jīng)典的甲基化酶催化模式來甲基化底物，這為我們?cè)赟f9中探尋DNMT2的功能提供了線索。此外我們還在Sf9細(xì)胞中克隆出了編碼DNMT1的基因，它也與其他物種中的同源蛋白有很高的相似度，與家蠶DNMT1的相似度為83％、與黑脈金斑碟的DNMT1高達(dá)74％、與蜜蜂的DNMT1相似度為50％，與人的DNMT1也有49％的相似度。結(jié)構(gòu)域分析表明除了甲基化酶催化區(qū)以外，DNMT1在其N端區(qū)，包括復(fù)制叉識(shí)別結(jié)構(gòu)域(RFD)、CXXC結(jié)構(gòu)

10、域和兩個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域。DNMT1在病毒感染中所起的作用還在進(jìn)一步的研究中。
　　最后，我們用AcMNPV感染6小時(shí)和12小時(shí)的Sf9細(xì)胞連同未感染的細(xì)胞為對(duì)照樣本，進(jìn)行了細(xì)胞小RNA的深度測(cè)序。我們嘗試尋找在AcMNPV這種快速裂解性的病毒中是否存在microRNA的調(diào)控，或者細(xì)胞針對(duì)病毒感染有沒有產(chǎn)生microRNA進(jìn)行主動(dòng)防御。分析測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了30個(gè)AcMNPV來源的可能編碼microRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體序列，再根據(jù)成熟

11、體microRNA可能定位于5'或3'前體莖環(huán)臂上，一共預(yù)測(cè)出60個(gè)成熟體，對(duì)測(cè)到的讀值都進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。這些病毒來源的microRNA都是全新的，說明病毒編碼的microRNA的保守性相對(duì)比較差。同樣我們也測(cè)到很多宿主來源的microRNA，這些microRNA中有一部分是新的，另一部分是在已知數(shù)據(jù)庫中可以找到保守序列的。針對(duì)這些microRNA做表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)大部分都是針對(duì)病毒感染的不同時(shí)間點(diǎn)有相應(yīng)地提高。目前對(duì)病毒編碼和宿主來