人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠體內(nèi)分化為肝細(xì)胞的研究.pdf

1、肝臟是人類最重要的能量代謝、生物合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)化器官.嚴(yán)重肝臟疾病往往需要原位肝移植(OLT)才能夠獲得根治性的治療,但由于供肝數(shù)量有限、手術(shù)復(fù)雜且費(fèi)用高昂等原因原位肝移植手術(shù)難以廣泛開(kāi)展.肝細(xì)胞移植具有以下優(yōu)點(diǎn):①一個(gè)供體可給予多個(gè)受體提供細(xì)胞;②移植技術(shù)簡(jiǎn)單;③供肝細(xì)胞免疫原性低且可凍存;④可重復(fù)移植,如移植失敗,對(duì)受體的影響也十分微小.但肝細(xì)胞移植也面臨人類肝細(xì)胞來(lái)源有限,而異種移植(Xenotransplantation)免疫排斥

2、反應(yīng)劇烈等制約因素.肝干細(xì)胞具有多向分化能力,可分化為肝細(xì)胞與肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,肝干細(xì)胞研究的深入開(kāi)展為肝細(xì)胞來(lái)源開(kāi)辟了新途徑.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有多向分化能力,被稱作肝外源性肝干細(xì)胞.MSC在肝內(nèi)可演變?yōu)槁褕A細(xì)胞、肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞.MSC的這些特性使利用患者自身MSC進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化,然后自體細(xì)胞移植成為可能.從而可以同時(shí)解決移植細(xì)胞來(lái)源匱乏和移植后免疫排斥這兩個(gè)肝細(xì)胞移植面臨的主要問(wèn)題.目的:1.分離人胚胎MSC并體外培養(yǎng),摸

3、索人胚胎MSC的分離、培養(yǎng)方法.2.構(gòu)建肝損傷合并自身肝細(xì)胞再生抑制動(dòng)物模型.3.將人胚胎MSC移植入自身肝細(xì)胞再生抑制的肝損傷大鼠脾臟內(nèi),觀察其在大鼠體內(nèi)的分化演變,為肝細(xì)胞移植治療肝衰竭奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).材料和方法:1.用密度梯度離心法分離流產(chǎn)胎兒的MSC,用MEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后檢測(cè)人胚胎MSC含量和活性.2.用AAF灌喂大鼠后行肝部分切除,分時(shí)段檢測(cè)肝功.3.將人胚胎MSC移植到肝損傷合并自身肝細(xì)胞再生抑制大鼠脾臟,術(shù)后分時(shí)段取脾臟

4、、肝臟免疫組化染色了解人ALB、CK 8、CK 18、CK19的表達(dá)情況,糖原染色了解細(xì)胞內(nèi)糖原含量.結(jié)果:1. 分離獲得的人胚胎MSC含量為85﹪~93﹪.體外培養(yǎng)7天后人胚胎MSC含量大于93﹪,細(xì)胞活性在95﹪以上.2.AAF灌喂后肝損傷大鼠的肝再生抑制明顯,肝功能恢復(fù)緩慢.3.人胚胎MSC移植后10天大鼠脾臟的人CK8、CK18、CK19免疫組化染色即可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞,移植后2周大鼠脾臟組織內(nèi)人ALB免疫組化染色可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞,以后至

5、12周均有陽(yáng)性顯示.未進(jìn)行MSC移植的對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞.人胚胎MSC移植后大鼠肝臟免疫組化染色結(jié)果和脾臟相似,染色陽(yáng)性細(xì)胞主要位于移植后大鼠肝臟的匯管區(qū),這也說(shuō)明其來(lái)源是由脾臟經(jīng)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟.對(duì)照組肝臟未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞.人胚胎MSC移植后2周大鼠脾臟糖原染色可見(jiàn)陽(yáng)性,至第12周仍可以檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞,顯示分化后細(xì)胞具有一定的糖原合成能力.結(jié)論:1.用密度梯度離心法分離后MEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)的人胚胎MSC純度高,生物活性好.2.AAF灌喂后