植物控制核黃素合成及相關(guān)氧化還原反應(yīng)的三個(gè)關(guān)鍵基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、核黃素在生物體內(nèi)形成黃素單核苷酸FMN及黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，它們是黃素酶的輔酶。核黃素所形成的輔酶參與機(jī)體組織維生素C抗氧化作用的呼吸電子傳遞及氧化還原過程，參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應(yīng)過程中活性氧中間體(ROIs)的產(chǎn)生，而ROIs是過敏細(xì)胞壞死的重要信號(hào)，能調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應(yīng)有關(guān)。核黃素在植物和微生物中都能自我合成，合成途徑的倒數(shù)第二步是由2,4-二氧四氫喋啶合

2、酶(lumazine synthase，LS)催化的，最后一步是由核黃素合酶(riboflavin synthase，RS)催化的。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)LS與茉莉酸途徑相交叉，與根對(duì)茉莉酸的敏感性、植物的抗病性密切相關(guān)。由此可推斷水稻上的OsLS和OsRS很可能存在著許多不為所知的功能，在植物上關(guān)于編碼這兩個(gè)酶的基因的報(bào)道不多，尤其是水稻的這兩個(gè)基因目前還沒有得到克隆。 本實(shí)驗(yàn)室首次從水稻中克隆到核黃素合成過程的倒數(shù)第二步和最后一步關(guān)

3、鍵酶的編碼基因OsLS和OsRS：OsLS基因全長(zhǎng)666 bp，在氨基酸序列上與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、菠菜(Spinacia oleracea)和煙草(Nicotiana tabacum)的LS基因的同源性非常高。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，在同一個(gè)進(jìn)化分枝內(nèi)。OsRS序列全長(zhǎng)1662bp，與Gene ID OJ1111H02.Predgene04的不合內(nèi)含子和非翻譯區(qū)的序列完全一致。原核表達(dá)LS和RS蛋白質(zhì)，能

4、分別得到包括His-tag在內(nèi)的29.85 kD和66.37 kD大小的OsLS和OsRS蛋白質(zhì)，分子大小與預(yù)期一致。以100μg/ml水稻細(xì)條斑病菌的激發(fā)子蛋白質(zhì)HpaG<,Xoo>做陽(yáng)性對(duì)照，不同濃度的OsLS和OsRS蛋白質(zhì)溶液注射煙草葉片，結(jié)果表明不能引發(fā)煙草葉片的過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，表明上述兩種蛋白質(zhì)在煙草上的反應(yīng)不同于HpaG<,Xoo>激發(fā)子。本研究利用相關(guān)軟件分析了兩種蛋白的

5、生化特性、亞細(xì)胞定位和高級(jí)結(jié)構(gòu)。 作者將克隆到的OsLS和OsRS連接到了植物表達(dá)載體pBI121上，測(cè)序證明構(gòu)建好的質(zhì)粒序列是正確的，然后在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，通過Horsch葉盤法將連有OsLS和OsRS的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到了煙草上。根據(jù)pBI121上攜帶的卡那霉素抗性基因初步篩選到了陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草植株。通過PCR和Southern雜交方法證明OsLS和OsRS基因已經(jīng)整合到了煙草的染色體上，RT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的OsLS和O

6、sRS基因在轉(zhuǎn)基因植物中能夠高效表達(dá)。由于啟動(dòng)SA、JA和乙烯信號(hào)通路的激發(fā)子均可刺激核黃素合成基因表達(dá)，使核黃素含量提高，同時(shí)它們與核黃素一樣均誘導(dǎo)對(duì)細(xì)菌的抗性，因此核黃素在組織內(nèi)的含量變化可能影響抗病防衛(wèi)基本信號(hào)通路。本研究對(duì)篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，相對(duì)于轉(zhuǎn)空載體煙草植株，OsLS和OsRS轉(zhuǎn)基因煙草中游離態(tài)的核黃素、FAD和FMN含量都有所升高，同時(shí)，觀測(cè)表明，分別表達(dá)OsLS和OsRS的轉(zhuǎn)基因煙草植株發(fā)

7、生了種子萌發(fā)速度、株高等多種生長(zhǎng)表型改變。這些結(jié)果為研究核黃素含量對(duì)植物抗病防衛(wèi)和生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控提供了依據(jù)，OsLS和OsRS轉(zhuǎn)基因煙草材料的產(chǎn)生為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。 硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是一種小分子量蛋白質(zhì)，催化巰基．二硫鍵的交換反應(yīng)，參與細(xì)胞還原環(huán)境的調(diào)節(jié)，廣泛存在于植物的各種組織和器官內(nèi)，在新陳代謝中有重要作用，如消除氧脅迫、參入蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本研究從煙草中克隆了硫氧還蛋白基因Nt

8、TRX-hl，并推導(dǎo)出NtTRX-hl的氨基酸序列。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，NtTRX-hl與小麥、大麥、擬南芥等多種植物的TRX蛋白有很高的同源性。構(gòu)建高效表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)重組菌得到分子大小為22.3kDa的融合蛋白，與推測(cè)的分子量一致。用胰島素和二硫蘇糖醇作底物進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果表明NtTRX-hl具有活性。軟件分析了NtTRx-hl蛋白的生化參數(shù)和亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)了該蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這些工作為進(jìn)一步探討NtTRX-hl的功能奠定