T3調(diào)控下丘腦GT1-7神經(jīng)元細胞KISS-1基因表達的研究.pdf

1、目的：
　　研究T3對下丘腦GT1-7神經(jīng)元細胞中KISS-1基因表達的影響。
　　方法：
　　1、利用RT-PCR的方法驗證GT1-7細胞中KISS-1基因表達。
　　2、分別用realtime PCR和western blotting的方法，觀察200ng/ml T3作用GT1-7神經(jīng)元細胞不同時間(12、24、48、72h)后KISS-1基因mRNA和蛋白表達的變化。
　　3、用TRα、TRβsiRN

2、A轉(zhuǎn)染GT1-7細胞，western blotting檢測干擾效果，選擇有效的干擾序列轉(zhuǎn)染GT1-7細胞后，T3干預(yù)GT1-7細胞24h，用realtime PCR方法測定KISS-1基因mRNA表達。
　　4、構(gòu)建2kb的KISS-1啟動子報告基因體系（PGL3-Kiss1 promoter），不同濃度(0、20、200、2000ng/ml)T3作用GT1-7神經(jīng)元細胞24h后，運用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定KISS-1啟動

3、子活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR顯示140bpKISS-1條帶。
　　2、realtime PCR結(jié)果顯示：200ng/ml T3作用GT1-7神經(jīng)元細胞不同時間（12-72h)后，與0h對照組相比，12h組KISS-1 mRNA表達增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），24h、48h、72h組KISS-1 mRNA表達顯著增加（p<0.01），其中48h組KISS-1mRNA表達增加最明顯。
　

4、　3、western blotting結(jié)果顯示：200ng/ml T3作用GT1-7神經(jīng)元細胞不同時間（12-72h)后，與0h對照組相比，12h組KISS-1蛋白表達開始增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），24h、48h、72h組KISS-1蛋白表達顯著增加（p<0.01），其中24h組KISS-1蛋白表達增加最明顯。
　　4、siRNA轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果：TRα、TRβsiRNA轉(zhuǎn)染GT1-7細胞48小時后，siRNA664、si

5、RNA1259組TR蛋白表達下降。選擇有效的siRNA轉(zhuǎn)染GT1-7細胞，200ng/ml T3干預(yù)細胞24h，與對照組相比，siRNA664組KISS-1 mRNA表達明顯降低（p<0.01），siRNA1259組KISS-1 mRNA表達降低（p<0.05）。
　　5、雙熒光素酶報告實驗結(jié)果：與對照組相比，20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml組KISS-1啟動子活性增強，其中200ng/ml組增強作用最明顯（p