一體化ACECM-HAp雙相支架構(gòu)建與骨軟骨界面組織工程應(yīng)用.pdf

1、研究背景:隨著社會(huì)人口老齡化及運(yùn)動(dòng)損傷的增多,骨關(guān)節(jié)病變的發(fā)生率在不斷上升,嚴(yán)重影響著人類生活質(zhì)量。引起骨軟骨損傷的相關(guān)病因很多,包括各種退變性疾病以及創(chuàng)傷性損害,隨著年齡增加,軟骨組織的自然磨損易導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生,是骨軟骨損害的主要原因。關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨共同構(gòu)成了一個(gè)相互依存的復(fù)合功能單元,兩者在解剖結(jié)構(gòu)上緊密相連,生物學(xué)功能相互影響。該功能單元具有材料梯度和生理特異的組織結(jié)構(gòu),不同層面的力學(xué)屬性、新陳代謝及分子運(yùn)輸均有差異,尤其軟

2、骨與骨之間的骨軟骨界面起著承上啟下的屏障作用。骨軟骨損傷同時(shí)累及關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨,兩者不同的組織成分和力學(xué)性能充分顯示出其組織界面的重要性,骨軟骨界面在防止力學(xué)失效和維護(hù)軟骨的正常功能是必需的,因此對(duì)骨軟骨缺損的修復(fù)必須同時(shí)考慮骨、軟骨和骨軟骨界面。目前組織工程策略的難點(diǎn)在于兩種不同組織之間界面無(wú)縫連接的仿生結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),這使得骨軟骨一體化再生成為了臨床和科研的熱點(diǎn)議題。因此,骨軟骨組織工程界面的開發(fā)將成為創(chuàng)傷性骨軟骨缺損和退變性關(guān)節(jié)疾病

3、治療的新策略。本研究包括以下內(nèi)容:(1)探討骨軟骨缺損修復(fù)進(jìn)程中軟骨下骨重塑與軟骨再生的關(guān)系;(2)開發(fā)含有仿生界面的一體化雙相支架;(3)體外評(píng)估雙相支架的特征及生物學(xué)行為;(4)細(xì)胞復(fù)合支架體內(nèi)修復(fù)骨軟骨缺損及再生骨軟骨界面的作用機(jī)制探索。
　　方法:(1)取成年健康新西蘭大白兔,制備股骨滑車溝骨軟骨缺損自發(fā)性修復(fù)模型,于術(shù)后1、4、12、24周分別取材,行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,根據(jù)國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)組織學(xué)評(píng)分(I

4、CRS)量化評(píng)估,顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)掃描重建分析軟骨下骨的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。(2)基于前期研究成果,選用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ACECM)和羥基磷灰石(HAp)納米顆粒配比,運(yùn)用物理濕法粉碎及脫細(xì)胞技術(shù)、“液相合成擴(kuò)散(LPCI)”技術(shù)、改良熱致相分離(TIPS)技術(shù)、物理與化學(xué)交聯(lián)和冷凍干燥等多項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建包含非礦化相和礦化相及連續(xù)界面的一體化仿生支架,并對(duì)其理化表征進(jìn)行檢測(cè)以及生物力學(xué)與滲透特性進(jìn)行評(píng)估。(3)將種

5、子細(xì)胞種植于雙相支架中體外構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合物并進(jìn)行系列檢測(cè),觀察細(xì)胞在雙相支架中粘附、增殖及生長(zhǎng)分布情況,并將細(xì)胞支架復(fù)合物植入小鼠背部皮下,進(jìn)行活體熒光成像及組織學(xué)檢測(cè)。(4)將種子細(xì)胞以不同方式種植于 ACECM/HAp雙相支架上體外構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合物,植入兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損,術(shù)后于4、12、24周不同時(shí)間點(diǎn)分次取材,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)染色及量化評(píng)分、生化定量檢測(cè)、Micro-CT掃描及生物力學(xué)評(píng)估。
　　結(jié)果:(

6、1)骨軟骨損傷模型隨時(shí)間延長(zhǎng)可不同程度自發(fā)性修復(fù),缺損區(qū)逐漸被修復(fù)組織填充平整,缺損區(qū)內(nèi)軟骨下骨板逐漸向上遷移。骨礦物質(zhì)密度、骨體積分?jǐn)?shù)、組織礦化密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度均逐漸增加,而骨小梁間隙寬度逐漸下降;軟骨組織學(xué)表現(xiàn)為纖維性修復(fù)為主,透明軟骨少見;隨時(shí)間延長(zhǎng),術(shù)后ICRS組織學(xué)評(píng)分逐漸增加;軟骨下骨相關(guān)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)中,除骨小梁間隙寬度與ICRS組織學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.584)外,其它各參數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.680

7、~0.891),但軟骨下骨重塑與軟骨修復(fù)的進(jìn)程并不完全同步。(2)實(shí)驗(yàn)采用ACECM和納米HAp兩種不同材料,結(jié)合運(yùn)用改良TIPS及LPCI等技術(shù),成功制備出含有礦化層與非礦化層及連續(xù)界面的雙相支架,界面處有良好的結(jié)構(gòu)的完整性,支架上層孔結(jié)構(gòu)呈微管樣具有良好的孔間連通性,垂直方向呈平行取向排列,而下層內(nèi)呈隨機(jī)排列。兩層內(nèi)各自的微孔結(jié)構(gòu)相對(duì)均勻,但孔徑和孔隙率存在明顯差異(P<0.05),呈“上大下小,上疏下密”的特征,兩層孔徑的變化從1

8、28.2±20.3μm縮小至21.2±3.1μm,上層的孔隙率為92.6±6.2％,而礦化層的孔隙率因HAp含量的增加而從44±3.2%降至30±4.1%。掃描電子顯微鏡(SEM)示,孔形態(tài)逐漸由管型變?yōu)閳A形,呈現(xiàn)出類似天然骨軟骨界面的過渡結(jié)構(gòu)。力學(xué)試驗(yàn)顯示支架具有良好的抗壓縮及界面抗剪切性能,且界面區(qū)具有低滲透率的物理屏障作用,其中7w/v%的HAp為最適宜的支架配比濃度。(3)體外實(shí)驗(yàn)CCK-8檢測(cè)和SEM觀察顯示軟骨細(xì)胞及BMSC

9、s在支架上層有良好的粘附和增殖,組織學(xué)、SEM觀察及共聚焦熒光顯微鏡下觀察均顯示ACECM/HAp雙相支架對(duì)細(xì)胞的分布起著導(dǎo)向作用和屏障作用,細(xì)胞在支架上層內(nèi)沿孔道排列分布,未見細(xì)胞穿越界面進(jìn)入下層內(nèi)。界面區(qū)域未見分層現(xiàn)象,可提供適宜細(xì)胞增長(zhǎng)的微環(huán)境。細(xì)胞-支架復(fù)合物的活性評(píng)估和皮下埋植實(shí)驗(yàn)顯示支架上層保留了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要的成分具有軟骨誘導(dǎo)性,下層含有鈣磷等礦物質(zhì)成分具有骨引導(dǎo)性,界面區(qū)的低滲透性具有阻隔效應(yīng),且無(wú)細(xì)胞毒性,具備

10、良好的生物相容性。(4)體內(nèi)試驗(yàn)組織學(xué)染色結(jié)果顯示成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs或軟骨細(xì)胞復(fù)合ACECM/HAp雙相支架組修復(fù)效果優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05),尤其術(shù)后24周,修復(fù)區(qū)軟骨厚度恢復(fù)正常,基質(zhì)染色正常,新生軟骨及周圍軟骨細(xì)胞形態(tài)正常,骨軟骨界面及潮線再生,軟骨下骨重建完成與周圍骨組織完全整合;壓痕力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示24周時(shí)新生軟骨具有良好的楊氏模量,與正常軟骨比較無(wú)差異(P>0.05);Micro-CT掃描觀察發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量的軟骨下骨形成;

11、觀察期內(nèi)植入物無(wú)一脫落,顯示支架植入時(shí)具有良好的初始穩(wěn)定性。
　　結(jié)論:(1)自發(fā)性骨軟骨修復(fù)進(jìn)程中,軟骨下骨重塑與軟骨再生密切相關(guān)且獨(dú)立發(fā)生,軟骨下骨的快速重塑可能負(fù)面影響關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果。(2)選取納米ACECM和HAp材料,采用系列優(yōu)化技術(shù),以天然全層骨軟骨組織的結(jié)構(gòu)作為模板,遵循“一體化”分層支架的設(shè)計(jì),成功構(gòu)建出用于骨軟骨界面組織工程的新型雙相支架。雙相支架上層為非礦化的大孔取向結(jié)構(gòu),下層為礦化的小孔蜂窩結(jié)構(gòu),兩層間的界

12、面以嵌合錨定的方式一體化整合,且具有良好的抗壓縮和抗剪切性能。支架界面具有低滲透效應(yīng)可提供上下兩層區(qū)域各異的特征,此具有成分-結(jié)構(gòu)-功能仿生的雙相支架符合界面組織工程的要求。(3)ACECM/HAp雙相支架具備空間導(dǎo)向控制細(xì)胞分布的能力,可提供適合種子細(xì)胞增殖和軟骨再生獨(dú)特的微環(huán)境,具有良好的細(xì)胞和組織相容性。支架生化成分及結(jié)構(gòu)具有雙相仿生的特性,并具備獨(dú)特的界面阻隔效應(yīng),在體外能形成穩(wěn)定連續(xù)的組織界面,可模擬骨軟骨界面的組織特性,適合