靜脈石生物礦化機制的初步研究.pdf

1、脈管性疾病(Vascular anomalies)包括血管瘤(Hemangioma)和脈管畸形(Vascular malformation)二大類，可發(fā)生于全身各個部位，其中發(fā)生于頭頸部的脈管性疾病約占全身同類疾病的4096～60％，除了造成美容缺陷外，還可引起相應功能障礙，給患者帶來極大的精神創(chuàng)傷和心理負擔。靜脈石為頭頸部靜脈畸形中較常檢出的病理性礦化灶，伴隨著疾病的發(fā)展。一般認為，靜脈石是由于病灶內(nèi)血流動力學改變，血液中的鹽類物質沉

2、積并形成血栓，血栓進一步鈣化所形成。然而，此礦化機制尚屬推測，因此有必要進一步探討靜脈石的生物礦化機制。本研究從靜脈石的角度出發(fā)，探討靜脈畸形的病理機制，目的在于深入認識靜脈畸形的病理過程，在此基礎上以期預防、調(diào)整，甚至逆轉靜脈石的形成，獲得更好的治療效果。 生物礦化(Biomineralization)是指有機體調(diào)控下形成礦物質的過程。當機體對生物礦化調(diào)控作用失衡，無機離子在不該礦化的部位形成異位礦化或異常礦化組織，或造成礦化

3、組織礦化過度或不足稱為病理性礦化(Pathologicalmineralization)。感染是影響病理性礦化過程的一個重要因素。上世紀八十年代后期，芬蘭科學家Kajander等在進行哺乳動物細胞培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在一種超微原核微生物，認為此微生物可能來自細胞培養(yǎng)所需的胎牛血清。1990年Kajander正式將這種原核微生物命名為納米細菌(Nanobacteria， NB)，并申請了專利。近年這種超微結構亦被稱為鈣化性納米顆粒(Cal

4、cifyingNanoparticles，CNP)。納米細菌廣泛存在于自然界的礦物質中和生物體內(nèi)，是一種人畜共患的致病原，能感染人類和其它哺乳動物的任何組織和細胞，其生長過程中能在菌體周圍產(chǎn)生堅硬的礦化外殼，作為結晶核心，導致被感染組織或細胞發(fā)生病理性礦化。研究發(fā)現(xiàn)，納米細菌與人體內(nèi)多種組織的病理性鈣化和硬化的發(fā)生、發(fā)展相關。 納米細菌的提出，為研究靜脈石的礦化機制提供一個新的切入點，因此我們設想納米細菌與靜脈石的形成相關。本研

5、究首先對靜脈石進行超微結構及化學成分分析，再試圖從靜脈石中分離、培養(yǎng)出納米細菌，以探索靜脈石的生物礦化機制。 第一部分：靜脈石的超微結構分析 目的：明確靜脈石的超微結構。 方法：5例靜脈石，過中心剖開，分別從內(nèi)部和外層各取一小塊，噴金處理后，掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)下觀察其超微結構。 結果：SEM下發(fā)現(xiàn)靜脈石由內(nèi)至外呈同心圓板層狀結構，4例靜脈石內(nèi)

6、部和外層的超微結構均以針狀晶體為常見，該晶體與羥基磷灰石相似；1例靜脈石內(nèi)部亦以針狀晶體為主，而外層為緊密排列的條索狀結構。 結論：靜脈石的形成過程為先形成礦化核心，其他物質圍繞核心呈同心圓逐層沉積而成，其內(nèi)可能含羥基磷灰石晶體。 第二部分：靜脈石的化學成分分析 目的：明確靜脈石的化學成分組成。 方法：5例靜脈石，過中心剖開，分別從內(nèi)部和外層各取一小塊，能量色散型X一射線分析儀(Energy Disper

7、sive X-ray spectrometry， EDS)下分別定量檢測靜脈石內(nèi)部和外層的元素組成。另取一小塊研成粉末，X-射線衍射分析儀(X-ray diffraction analysis，XRD)下進行物相分析。 結果：EDS下3例靜脈石內(nèi)部和外層含有的元素依次為氧、鈣、磷、鈉、鎂，前三者質量含量超過98％，另外2例靜脈石內(nèi)部和外層還有較高含量的碳元素。4例靜脈石鈣磷質量及原子比值在內(nèi)部和外層都較接近，質量比為1.73～

8、2.35：1，原子比為1.34～1.81：1。5例靜脈石鈣磷含量平均值的質量及原子比在內(nèi)部分別為2.15：1和1.67：1，在外層分別為1.83：l和1.41：1。XRD物相分析顯示4例靜脈石為羥基磷灰石結晶，1例靜脈石為非結晶物質。 結論：靜脈石的形成過程為有機物呈同心圓樣逐層沉積，并由內(nèi)至外逐步礦化為無機物而成，其晶相為羥基磷灰石晶體。 第三部分：靜脈石中納米細菌的分離、培養(yǎng)與初步鑒定 目的：明確靜脈石的形成

9、是否與納米細菌相關，以探索靜脈石的生物礦化機制。 方法：靜脈石中納米細菌的分離和培養(yǎng)：14例靜脈石脫礦后研碎，重懸粉末，離心，收集上清經(jīng)O．22p,m濾器過濾至培養(yǎng)瓶，加入含10％ γ-射線滅活的胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)，在37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。納米細菌的初步鑒定：倒置相差顯微鏡觀察該菌形態(tài)及生長特性，單克隆抗體8D10和G1B8免疫細胞

10、化學染色和間接免疫熒光細胞化學染色檢測納米細菌抗原，透射電鏡(Transmission electron microscope，TEM)觀察培養(yǎng)細菌的超微結構。 結果：78.6％(11/14)的靜脈石分離、培養(yǎng)出納米細菌樣顆粒，其形態(tài)學特征和生長特性與納米細菌相似，單克隆抗體免疫細胞化學染色和間接免疫熒光細胞化學染色均呈陽性，電鏡觀察到納米大小菌樣顆粒。 結論：從靜脈石中能分離到納米細菌，該菌可能在靜脈石的形成中起重要作