纖維連接蛋白粘附共培養(yǎng)對(duì)伊馬替尼誘導(dǎo)慢性髓系白血病細(xì)胞凋亡影響的研究.pdf

1、背景與目的： 盡管近40年來白血病的治療取得了極大的進(jìn)展，但白血病耐藥、殘留、難治、復(fù)發(fā)仍是目前治療的巨大障礙和亟待解決的難題，因此，很有必要進(jìn)一步深入研究白血病細(xì)胞耐藥的生物學(xué)背景。 傳統(tǒng)的耐藥研究采用的是單細(xì)胞培養(yǎng)模型，不能很好地模擬腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)及腫瘤微環(huán)境，目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境的粘附作用參與其耐藥的產(chǎn)生，血液系統(tǒng)腫瘤微環(huán)境即骨髓微環(huán)境，骨髓微環(huán)境介導(dǎo)耐藥已成為目前血液學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。骨髓微環(huán)境的異常貫穿

2、白血病的發(fā)生、發(fā)展全過程，同時(shí)，它也可為白血病細(xì)胞提供一個(gè)保護(hù)性微環(huán)境，使之免于藥物的殺傷而導(dǎo)致治療后體內(nèi)白血病細(xì)胞殘留、耐藥、復(fù)發(fā)。但白血病細(xì)胞與骨髓微環(huán)境間相互作用的分子機(jī)制目前尚未徹底闡述清楚。 研究方案： 1．伊馬替尼不同劑量以及不同作用時(shí)間處理K562細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)各組OD值，計(jì)算、比較各組的細(xì)胞增殖抑制率，確定伊馬替尼對(duì)K562白血病細(xì)胞的最佳處理?xiàng)l件。 2．K562細(xì)胞分別接種纖維連接蛋白包被

3、組（Fn）、膠原蛋白包被組（Co）、懸浮培養(yǎng)對(duì)照組（mask），MTT法檢測(cè)各組OD值，計(jì)算Fn組、Co組粘附率，確定適宜的細(xì)胞接種密度。 3．伊馬替尼不同劑量以及不同作用時(shí)間處理K562細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)Fn、Co、mask各組OD值，計(jì)算、比較各組的細(xì)胞增殖抑制率，探討Fn粘附共培養(yǎng)在伊馬替尼抑制K562細(xì)胞增殖中的保護(hù)效應(yīng)。 4．不同劑量的伊馬替尼作用Fn、Co、mask各組K562細(xì)胞48小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀通

4、過AnnexinV-FITC/PI定量分析、比較各組細(xì)胞凋亡率的差異，探討Fn粘附共培養(yǎng)對(duì)伊馬替尼誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的影響。 5．不同劑量的伊馬替尼作用Fn、Co、mask各組CML原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞，在不同作用時(shí)間采用MTT法檢測(cè)各組的OD值，計(jì)算、比較各組的細(xì)胞增殖抑制率，探討Fn粘附共培養(yǎng)在伊馬替尼抑制CML病人骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖中的保護(hù)效應(yīng)。 6．K562細(xì)胞與Fn粘附共培養(yǎng)后，在不同的時(shí)間Pull down-

5、Wersten Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rho-GIP含量的改變，并進(jìn)一步比較Fn、Co、mask各組使用抗整合素分子單抗前后K562細(xì)胞p-FAK、Rho-GTP含量變化的差異，初步探討整合素蛋白活化前后對(duì)下游FAK、Rho蛋白活性的調(diào)控關(guān)系。 7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：探討實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素的最佳處理?xiàng)l件實(shí)驗(yàn)、各實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)及凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用析因方差分析，如經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)無顯著交互效應(yīng)，則退化為two-way ANOVA分析。Fn、Co組

6、間粘附率測(cè)定及Western Blot實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析。使用SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1．實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素最佳處理?xiàng)l件的確定。分別予0．0μM、0．4μM、0．8μM、1．6μM、3．2μM、6．4μM不同濃度的伊馬替尼作用K562細(xì)胞0h、24h、48h、72h后，比較不同濃度、不同時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率的差異，結(jié)果顯示，伊馬替尼不同劑量水平（F=117．592，P=0．000）、藥物不同作用

7、時(shí)間（F=194，981，P=0．000）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制均有顯著差異。 2．細(xì)胞粘附率的測(cè)定。K562細(xì)胞接種于Fn、Co、mask各組，24h后MTT法測(cè)3組平均OD值分別為0．53±0．14、0．61±0．17、1．03±0．20，組間總體比較有顯著差異（F=21．643，P=0．000），多重分析表明，F(xiàn)n與mask、Co與mask比較均有顯著差異，但mask與Co比較無顯著差異，提示Fn和Co兩者對(duì)K562細(xì)胞均有一定

8、的粘附能力，而兩者水平相當(dāng)。計(jì)算Fn、Co的粘附率（粘附培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的平均OD比值）分別為51．16%、59．11%。 3．比較伊馬替尼不同作用時(shí)間內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖抑制的差異。K562細(xì)胞接種于Fn、Co、mask各組，藥物作用24h、48h、72h后MTT法測(cè)定、計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率總體比較均存在顯著差異（P值分別為0．006、0．000、0．000），各觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)多重分析

9、總體比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n與mask、Fn與Co比較均有顯著差異，但mask與Co比較無顯著差異；各觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞的增殖抑制比較均有顯著差異（P=0．000）。提示Fn粘附培養(yǎng)可一定程度上減弱伊馬替尼對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制。 4．比較伊馬替尼不同劑量水平內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞凋亡率的差異。K562細(xì)胞接種于Fn、Co、mask各組，0．8μM、1．6μM伊馬替尼作用48h后流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI定量分析細(xì)

10、胞凋亡率，0．8μM劑量水平各組細(xì)胞總凋亡率（%）分別為16．24±3．47、26．05±3．44、30．55±6．43（F=7．378，P=0．024）；1．6μM劑量水平各組細(xì)胞總凋亡率（%）分別為35．33±1．63、48．91±3．72、55．26±6．31（F=16．528，P=0．004）：兩劑量水平內(nèi)各組多重分析結(jié)果相似，F(xiàn)n與mask、Co與mask比較均有顯著差異，但mask與Co比較無顯著差異，提示Fn粘附共培養(yǎng)可增

11、強(qiáng)K562細(xì)胞對(duì)伊馬替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抵抗。 5．比較伊馬替尼不同作用時(shí)間內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組間CML原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖抑制的差異。CML原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于Fn、Co、mask，藥物作用24h、48h、72h后MTT法測(cè)定、計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率總體比較均存在顯著差異（P值均為0．000），各觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)多重分析總體比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n與mask、Fn與Co比較均有顯著差異，但mask與Co

12、比較無顯著差異；各觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞的增殖抑制比較均有顯著差異（p=0．000）。提示Fn粘附培養(yǎng)可一定程度上減弱伊馬替尼對(duì)CML原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞的增殖抑制。 6．Fn粘附共培養(yǎng)后K562細(xì)胞Rho-GTP含量隨時(shí)間變化的改變。細(xì)胞接種Fn包被的培養(yǎng)板，分別于培養(yǎng)0h、24h、48h、72h收集細(xì)胞，Pull down-Werstern blot檢測(cè)Rho-GTP與GAPDH含量比值分別為0．4546±0．0179

13、、0．8729±0．0614、0．8654±0．0905、0．8362±0．0101（F=13．230，P=0．002），多重分析發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)0h與24h、48h、72h比較均有顯著差異，而粘附共培養(yǎng)24h、48h、72h間兩兩比較均無顯著差異。 7．Fn粘附共培養(yǎng)后K562細(xì)胞p-FAK、Rho-GTP含量的改變。細(xì)胞分別接種于Fn、mask、Co、Fn+抗CD29、mask+抗CD29、Co+抗CD29，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞

14、，Pull down-Werstern blot檢測(cè)p-FAK與GAPDH含量，各組含量比值分別為1．4067±0．2463、0．7971±0．1283、0．9724±0．2713、1．0236±0．1274、0．2266±0．0241、0．5610±0．0437（F=17．588，P=0．000）；各組Rho-GTP與GAPDH含量比值分別為1．0513±0．3920、0．3500±0．0624、0．5174±0．1099、0．757

15、9±0．2109、0．3277±0．1006、0．4246±0．0625（F=6．280，P=0．004）；各實(shí)驗(yàn)組間p-FAK、Rho-GTP含量的變化有顯著差異，多重分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n與mask、Fn與Co比較p-FAK、Rho-GTP含量有顯著差異（P<0．05），而mask與Co比較無顯著差異，F(xiàn)n粘附共培養(yǎng)后細(xì)胞p-FAK、Rho-GTP表達(dá)量增加，F(xiàn)n組使用抗CD29單抗后p-FAK含量顯著降低（P<0．05），而Rho-GTP

16、含量比較無顯著差異。 結(jié)論： 1．與Co粘附培養(yǎng)相比較，無論是K562細(xì)胞株細(xì)胞，還是CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)n粘附共培養(yǎng)均可明顯減弱伊馬替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡，提示特異性接觸粘附可能是細(xì)胞形成耐藥原因之一。 2．Fn與細(xì)胞特異性接觸粘附共培養(yǎng)減弱伊馬替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡效應(yīng)可能與Rho-GTP活性增強(qiáng)相關(guān)；應(yīng)用抗CD29單抗可顯著降低細(xì)胞內(nèi)p-FAK含量，但并不能顯著降低細(xì)胞內(nèi)Rho-