豬鏈球菌溶原性噬菌體裂解酶Ly7917的挖掘與生物活性研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種人畜共患病原菌，臨床分離株大多呈現對抗生素嚴重耐藥和多重耐藥，應用抗生素治療豬鏈球菌感染面臨巨大挑戰(zhàn)，而基于噬菌體的抗菌策略再現潛力。噬菌體的裂菌功效依賴于侵染后期合成的細菌細胞壁水解酶——裂解酶（endolysin），近年來，裂解酶也成為研發(fā)新型抗菌制劑的熱點。眾所周知，大多數病原菌存在前噬菌體（prophage），其基因組上一般含有裂解酶基因。故本文通過對GenBank中已完成全基因組測序的數株豬鏈球菌前噬菌體基因信息

2、分析，挖掘出一個由豬鏈球菌7型菌株前噬菌體編碼的裂解酶，進而系統研究了其生物學活性、發(fā)現了與裂菌活性相關的關鍵氨基酸位點并初步探索了嵌合裂解酶的研制方法。
　　為了實現裂解酶的高效表達，本研究以豬鏈球菌7型菌株7917基因組為模板，采用PCR技術擴增獲得裂解酶基因ly7917，將其克隆至質粒pET28a(+)中，構建了原核表達載體。通過對誘導溫度和時間等誘導條件的優(yōu)化，基于大腸桿菌表達系統獲得了大量的Ly7917。
　　為了

3、揭示Ly7917的生物學活性，基于平板裂解試驗測定了Ly7917的裂菌譜，結果顯示，該裂解酶對15株豬鏈球菌（包括2型、7型和9型）、39株金黃色葡萄球菌（包括18株MRSA菌株）和1株馬鏈球菌獸疫亞種參考株均具有裂解作用；基于濁度遞減試驗測定了Ly7917對不同菌株的裂解效率，結果表明，Ly7917對14株豬鏈球菌和1株馬鏈球菌的裂解效率高，對沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌不具有裂解作用；裂解酶的最適反應溫度和最適反應pH研究表明，

4、Ly7917在22-37℃范圍內裂解活性均較高，在酸性（pH4.5）和堿性（pH8.5）環(huán)境下仍能夠高效裂解高致病性豬鏈球菌菌株HA9801；Ly7917在4℃儲存的穩(wěn)定性研究表明，4℃放置1個月，活性單位由211降為28；凍融對裂解酶活性影響的研究表明，-80℃與室溫反復凍融10次后，活性單位由211降為29，而1次凍融則對裂解酶的活性沒有影響。
　　為了揭示Ly7917上與裂菌活性相關的關鍵氨基酸位點，本研究參考NCBI上報道

5、的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶CHAP催化域的晶體結構，預測了10個可能的關鍵氨基酸位點，并分別進行定點突變、表達及活性檢測。結果表明，Ly7917上的第26位半胱氨酸、102位組氨酸和118位谷氨酸均為維持Ly7917裂菌活性的關鍵氨基酸位點。
　　為了拓寬Ly7917的裂菌譜，本研究通過融合PCR技術，將ly7917與李斯特菌噬菌體裂解酶plyw001結合域cbd連接，構建原核表達載體ly7917-cbd-pET28a(+)和c

6、bd-ly7917-pET28a(+)，通過原核表達系統表達嵌合裂解酶Ly7917-CBD和CBD-Ly7917，平板裂解試驗表明Ly7917-CBD和CBD-Ly7917均能夠裂解HA9801，但不能裂解李斯特菌HA1073。
　　綜上所述，本文通過大腸桿菌原核表達系統，可溶性高效表達裂解酶Ly7917，且其裂菌譜廣，為裂解酶的臨床抗菌應用提供了可能；Ly7917穩(wěn)定性好、對外界環(huán)境耐受能力強，便于儲存及運輸；通過定點突變，發(fā)現