豬鏈球菌噬菌體SMP末端酶大亞單位的生物學(xué)活性研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis, S. Suis)是常見的人畜共患病病原菌,其中豬鏈球菌2型是流行范圍最廣、致病力最強(qiáng)、危害最嚴(yán)重的豬鏈球菌,能導(dǎo)致豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和人的腦膜炎,甚至?xí)氯怂劳?嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全。預(yù)防、治療豬鏈球菌病一般采用抗生素,但隨著抗生素的濫用,菌株的耐藥性不斷增強(qiáng),給該病的防控帶來了困難,基于噬菌體的治療策略再次成為研究熱點(diǎn)。末端酶(Terminase)是dsDNA病

2、毒包裝過程中的必要功能蛋白,其大亞單位在包裝過程中往往行使全酶的作用,一般具有 ATP酶活性和限制性內(nèi)切酶活性。豬鏈球菌噬菌體SMP是一株豬鏈球菌2型的烈性噬菌體,但目前對該噬菌體的末端酶的編碼基因和功能尚不清楚,本研究將通過大腸桿菌系統(tǒng)重組表達(dá)豬鏈球菌噬菌體末端酶大亞單位(TlsSMP),并研究TlsSMP融合蛋白的生物學(xué)活性。
　　本文利用SWISS-MODEL、NCBI CDD和PSIPRED等蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件預(yù)測了噬菌體(

3、SMP)末端酶大亞單位,結(jié)果顯示,末端酶大亞單位具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域?；诘鞍兹壗Y(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn),末端酶大亞單位與G2P(噬菌體SPP1核酸酶功能域)同源性最高,達(dá)到30.5％,重疊區(qū)域位于240aa-412aa處,預(yù)測的末端酶大亞單位具有末端酶的結(jié)構(gòu)特征。為了制備末端酶大亞單位,本文應(yīng)用大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有生物學(xué)活性的TlsSMP。以噬菌體SMP基因組為模板,采用PCR方法擴(kuò)增SMP末端酶大亞單位基因(TlsSMP),構(gòu)建pEas

4、y-E1-Tls重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。通過IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)于16℃誘導(dǎo)表達(dá)15 h,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE分析,確定其為53.26 kD大小的TlsSMP融合蛋白。Western-blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明, TlsSMP融合蛋白可被特異性血清識(shí)別,呈可溶性表達(dá)。為了揭示重組TlsSMP的生物學(xué)功能,應(yīng)用His-trap純化柱純化了融合蛋白,經(jīng)濃縮后,濃度可達(dá)1-1.5 mmol/L。基于磷酸檢測

5、試劑盒測定了TlsSMP融合蛋白水解ATP產(chǎn)生無機(jī)磷酸的水平,確認(rèn)其具有ATP酶活性,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),TlsSMP在pH7、23℃和Mg2+存在的條件下,其ATP酶活性最強(qiáng),其它金屬離子如Ca2+、Mn2+和Co2+都對其有不同程度的抑制作用。除了ATP酶活作用外,末端酶大亞單位是否還具有限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶的作用,尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。鑒于噬菌體末端酶在噬菌體等病毒包裝中的重要作用,通過深入研究可為研制安全、高效的抗病毒藥物、控制ds