重組人卵泡刺激素在昆蟲(chóng)細(xì)胞和巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、人卵泡刺激素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是糖蛋白家族成員之一,該家族除了FSH外還包括黃體生成素(luteinizing hormone,LH),促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH),絨毛膜促性腺激素(chorionicgonadotrophin hormone,CG),它們都是異二聚體,包括非共價(jià)結(jié)合的α亞基和β亞基.α亞基在上述每一種激素中

2、是相同的,是由同一基因編碼的,而β亞基對(duì)于每一種激素是特異的,決定其抗原性和生物活性.hFSH在生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用,因其刺激排卵和生精的作用,FSH目前在臨床上廣泛應(yīng)用于治療不孕不育.該研究的主要目的是探索一種生產(chǎn)成本較低,活性更好的表達(dá)重組人卵泡刺激素的表達(dá)系統(tǒng)和方法.該論文的工作是進(jìn)行人卵泡刺激素在昆蟲(chóng)細(xì)胞和巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá).首先我們是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)重組人卵泡刺激素.我們以重疊PCR的方法,從人染色體DNA中擴(kuò)增出h

3、FSH β亞基的cDNA的編碼區(qū),將其克隆入核型多角體病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表達(dá)載體pVLl393,得到了表達(dá)載體pVLl393-hFSH β.將其與BaculoGoldTM線形桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞SF9,經(jīng)多次擴(kuò)增后獲得高滴度的重組病毒AcNPV-hFSH β,然后將重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞,得到在胞漿中表達(dá)的hFSH β亞基,Western blot顯示分子量為2lkDa.最后以重組病毒AcNPV-hFSH β與AcN

4、PV-hCG α一同感染昆蟲(chóng)細(xì)胞,得到具有分泌性的重組hFSH異源二聚體,Western blot顯示分子量為33kDa.接著我們?cè)诎退沟庐叧嘟湍钢斜磉_(dá)單鏈重組人卵泡刺激素.hFSH的兩個(gè)亞基以非共價(jià)健相連,這種結(jié)合很不牢固,常常由于一些原因解離成單鏈,從而影響其活性.我們將兩個(gè)亞基以共價(jià)方式結(jié)合起來(lái)形成單鏈結(jié)構(gòu),為了不影響其空間結(jié)構(gòu)和活性,分別設(shè)計(jì)了兩種連接物(CTP linker和GS linker),在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行了單鏈重

5、組人卵泡刺激素的表達(dá).我們同樣是利用重疊PCR的方法分別獲得編碼hFSHβ-CTP37-hCGα的cDNA和hFSHβ-GSlinker-hCGα的cDNA,將它們克隆入畢赤酵母的表達(dá)載體pPIC9K中,分別得到表達(dá)載體pPIC9K/hFSHβ-CTP37-hCGα和pPIC9K/hFSHβ-GSlinker-hCGα.然后將這兩個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞GSll5,得到了可以分泌到培養(yǎng)液中的單鏈重組人卵泡刺激素FSHCTP和FSHGS