NS與PPP2R5A在HL-60白血病細胞內共定位及Pcmv Myc-PPP2R5A表達載體構建.pdf

1、目的:
　　 核干細胞因子(Nucleostemin,NS)是2002年發(fā)現(xiàn)的維持干細胞和癌細胞增殖狀態(tài)而不分化所必須的蛋白質,表達于干細胞和腫瘤細胞的核或核仁中,能與p53結合,人為控制或抑制NS的表達能改變癌細胞的病理性質[1]。本課題先前的研究發(fā)現(xiàn)NS在白血病細胞系HL-60、K562及不同類型的急性白血病中均存在高表達現(xiàn)象[2],NS的信號轉導方式普遍認為與p53有關,但這一理論無法解釋p53缺失型白血病和實體瘤細胞的一

2、些生物學現(xiàn)象。人蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphatase2A,PP2A)是一種絲／蘇氨酸磷蛋白磷酸酶,通過可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白質脫磷酸,在信號傳導承擔負性調節(jié)的作用,在細胞的凋亡、增生、分化、代謝中起重要作用。PPP2R5A是PP2A的調節(jié)亞單位B的α異構體(alpha isoform of protein phosphatase2 regulatory subunit B),決定了PP2A與底物的特異性,介導

3、PP2A在信號轉導中的作用[3],有資料顯示NS與PPP2R5A兩蛋白之間存在相互作用[4],但PPP2R5A在急性白血病細胞中是否表達,及其與NS是否有相互作用,目前國內外還未見報道。該課題總的目標是探討是否存在非p53依賴的NS信號傳導途徑?非p53依賴的NS信號傳導途徑是否與PPP2R5A蛋白和PP2A介導的信號通路有關?本課題是其子課題,旨在驗證在p53缺失型細胞內是否有NS與PPP2R5A的表達和共定位,以及構建pCMV My

4、c-PPP2R5A表達載體,轉染HL-60細胞,擴大PPP2R5A表達,為驗證NS與PPP2R5A存在相互作用的co-IP奠定基礎。
　　 方法:
　　 (1)RT-PCR、免疫組化和方法檢測PPP2R5A在HL-60白血病細胞系以及急性白血病患者外周血單個核細胞中的表達情況。
　　 (2)PT-PCR方法檢測NS基因和p53基因在HL-60細胞中的表達。
　　 (3)雙重免疫熒光染色法和激光光共聚焦技術

5、觀察NS和PPP2R5A兩種蛋白在HL-60細胞中的共定位情況。
　　 (4)構建pCMV Myc-PPP2R5A重組表達載體,轉化DH5α,提取質粒,應用PCR技術和測序方法鑒定重組克隆。
　　 (5)將pCMV Myc-PPP2R5A重組表達載體轉染HL-60細胞,使PPP2R5A蛋白在HL-60細胞內表達增強。
　　 (6)數(shù)據(jù)結果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理,對定量資料,統(tǒng)計學均數(shù)用均數(shù)±標準差((x)

6、±SD)表示；對定性資料采用x2檢驗；多樣本均數(shù)比較采用方差分析,方差不齊時進行變量變換。顯著性檢驗水準為α=0.05。
　　 結果:
　　 (1)PPP2R5A在白血病細胞中的表達:RT-PCR、免疫組化和Western blot結果顯示PPP2R5A在白血病細胞系HL-60和急性白血病患者(M5、M2、M3、ALL、混合性白血病)的外周血單個核細胞中呈表達狀態(tài),且在各類急性白血病中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05

7、)。
　　 (2)p53基因在HL-60細胞中的表達:PT-PCR結果顯示p53基因在HL-60細胞中不表達。
　　 (3)NS和PPP2R5A兩種蛋白在HL-60細胞中的共定位情況:激光共聚焦結果顯示NS和PPP2R5A兩種蛋白在HL-60細胞胞漿和胞核中均有表達,其中NS蛋白以核仁表達為主,PPP2R5A蛋白以胞漿表達為主,二者存在共定位現(xiàn)象。
　　 (4)載體構建及轉染結果:成功構建pCMV myc—PPP