MDR1shRNA的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞ACHN多藥耐藥的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建2條由pSIREN-RetroQ-ZsGreee(pRZ)質(zhì)粒載體介導(dǎo)MDR1短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達(dá)載體，針對(duì)MDR1基因過度表達(dá)機(jī)制，研究干擾片段逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞ACHN多藥耐藥的可行性。
　　 方法：1)分別針對(duì)MDR1基因的兩個(gè)不同位點(diǎn)， 按BarnHI+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+EcorI結(jié)構(gòu)合成編碼shRNA的DNA序列及其反義序列，退火連

2、接及磷酸化形成雙鏈后將其依次連入pRZ載體，構(gòu)建成能產(chǎn)生MDR1短發(fā)卡RNA的質(zhì)粒。2)體外培養(yǎng)腎癌細(xì)胞ACHN，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入ACHN。3)MTT法測(cè)定細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素(ADM)的敏感性，免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞膜表面P-gp表達(dá)，半定量RT-PCR檢測(cè)MDR1基因的表達(dá).4)采用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)均采用x±S表示，組間比較均采用兩樣本配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有顯著性。

3、
　　 結(jié)果：構(gòu)建成的質(zhì)粒pRZ-A、pRZ-B(pSIREN-RetroQ-ZsGreee-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreee-B)經(jīng)酶切與測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，無任何堿基突變；熒光倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染pRZ-A和pRZ-B后24h、48h、96hACHN綠色熒光蛋白表達(dá)，其中轉(zhuǎn)染48h的綠色熒光蛋白表達(dá)最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率分別為75.35±1.15％、74.83±1.37％；MTT顯示轉(zhuǎn)染后的ACHN顯著提高了對(duì)化療藥

4、物ADM的敏感性，ACHN空白對(duì)照組的IC50約為2.5ug/ml，轉(zhuǎn)染pRZ-A、pRZ-B ACHN IC50分別下降為0.65ug/m1、0.7ug/ml，較空白對(duì)照組分別下降了83.44％和83.42％；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示細(xì)胞表達(dá)P-gP水平明顯降低，轉(zhuǎn)染pRZ-A 96h細(xì)胞P-gp的陽性表達(dá)率與空白對(duì)照組有差異顯著性(t=15.621 P＜0.05)，下降了44.69％。轉(zhuǎn)染pRZ-B48h(t=2.415)和96h(t=17

5、.995)的細(xì)胞P-gp的陽性表達(dá)率與空白對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，分別下降了7.32％和53.62％；半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染pRZ-A、pRZ-BMDR1 mRNA基因表達(dá)顯著降低，與未轉(zhuǎn)染ACHN相比，分別下降了82.5％和77.5％；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2條序列抑制MDR1基因表達(dá)差別無顯著性(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了能表達(dá)MDR1 shRNA的質(zhì)粒載體pRZ-A和pRZ-B；其能有效地逆轉(zhuǎn)腎癌耐藥細(xì)胞