2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、腫瘤是一類嚴重威脅到人類健康與生命的疾病。近年來盡管抗腫瘤藥物已經(jīng)有了很大的發(fā)展,但仍存在著針對性差,殺傷正常細胞的毒副作用。因此研制能夠靶向性殺傷腫瘤細胞的基因工程藥物有重大的理論和實踐意義。 本組前期工作中利用EGF與EGFR結(jié)合的靶向性及腺病毒E4orf4蛋白的細胞毒性,通過基因重組及酵母表達技術(shù),已設(shè)計并表達了一種新的融合蛋白EGF—E4orf4。前期工作表明,該融合蛋白對人乳腺癌細胞MDA—MB—231,人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤

2、細胞BT325和人骨肉瘤細胞Saos—2都有抑制作用,但尚存在重組蛋白EGF—E4orf4表達量偏低,純化效率不高等問題。本論文在此基礎(chǔ)上,對融合蛋白EGF—E4orf4的表達,純化和功能三個方面進行了進一步的探索。 本論文的第一部分工作是提高融合蛋白的表達量和純度。利用5L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵表達,與搖瓶相比較,提高了融合蛋白的表達量。優(yōu)化純化流程,通過超濾結(jié)合離子交換和凝膠過濾兩步柱層析純化,提高了目的蛋白的純度。經(jīng)鑒定,重

3、組融合蛋白EGF—E4orf4是以蛋白聚合體形式存在,為進一步提高純化效率帶來了困難。為此,對該蛋白進行了改造:(1)在融合蛋白的羧基端添加(His)6標簽,以便于提高純化效率。(2)以可以與EGFR結(jié)合的環(huán)七肽替代融合蛋白中的EGF,構(gòu)建環(huán)七肽—E4orf4—His融合蛋白,減少二硫鍵的數(shù)目,并且可以排除E4orf4蛋白的細胞毒性作用受到EGF的促生長作用干擾的可能性。通過親和層析和凝膠過濾層析,對上述兩種蛋白進行純化,得到純度較高的

4、目的蛋白。 本論文的第二部分工作是進一步研究融合蛋白EGF—E4orf4的生物學(xué)功能。主要以人乳腺癌細胞MDA—MB—231和人胃癌細胞BGC823為實驗對象。通過Western blotting檢測EGFR磷酸化程度,發(fā)現(xiàn)融合蛋白EGF—E4orf4可以誘導(dǎo)EGFR發(fā)生磷酸化,并且呈時間和劑量依賴性。通過激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標記的融合蛋白和EGF孵育不同時間后的細胞,發(fā)現(xiàn):FITC—EGF進入細胞后信號逐漸減弱,并且與

5、溶酶體共定位;而FITC—EGF—E4orf4則隨著孵育時間延長,信號在細胞內(nèi)累積增強,并且在24h不與溶酶體共定位。融合蛋白EGF—E4orf4的抗腫瘤作用則表現(xiàn)在抑制BGC823細胞的克隆形成能力以及抑制MDA—MB—231和BGC823細胞的裸鼠移植腫瘤的生長,最大抑瘤率分別為79%和49%(P<0.05)。在急毒實驗中未發(fā)現(xiàn)EGF—E4orf4蛋白對裸鼠有任何毒副作用。 最后一部分工作是構(gòu)建了四環(huán)素可誘導(dǎo)表達E4orf4

6、蛋白的真核細胞穩(wěn)定表達株,并通過MTT實驗證明誘導(dǎo)表達E4orf4蛋白可以抑制細胞生長。以未誘導(dǎo)細胞為對照,對四環(huán)素誘導(dǎo)E4orf4蛋白表達6h和60h的細胞進行全基因組芯片掃描,作了初步分析,為今后研究E4orf4蛋白在細胞內(nèi)的作用機制奠定了基礎(chǔ)。 綜合上述研究結(jié)果表明,融合蛋白EGF—E4orf4確實可以通過EGFR這個分子靶點的介導(dǎo),進入腫瘤細胞,體內(nèi)實驗證明,融合蛋白EGF—E4orf4可以特異地抑制腫瘤細胞增殖,并具有

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