富氫水對(duì)大鼠急性-氧化碳中毒腦損傷保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一氧化碳(carbonmonoxideCO)中毒是一種常見的中毒性疾病，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命。部分重度中毒患者常因累及大腦、心臟等多個(gè)重要臟器，即使挽救了生命，也常留下遲發(fā)性神經(jīng)精神后遺癥，嚴(yán)重影響了生存者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。因此，如何盡早對(duì)急性CO中毒腦損傷采取有效治療手段并防治遲發(fā)性中毒后腦病(DelayedneurologicsequelaeDNS)，已經(jīng)成為臨床上迫切需要解決的問題。
　　 自

2、由基損傷是急性CO中毒腦損傷的主要發(fā)病機(jī)制。自由基與人類的健康和疾病密切相關(guān)，是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。過量產(chǎn)生的自由基會(huì)導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)和蛋白的氧化損傷，其中羥自由基(.OH)和過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)毒性強(qiáng)，目前為止還沒有在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的有針對(duì)性的清除方式。2007年，有學(xué)者在《Naturemedicine》報(bào)道，動(dòng)物呼吸2％的氫就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血再灌注損傷。
　　 本課題采用吸入法建立大鼠急

3、性CO中毒腦損傷模型，該模型為CO中毒的常用模型，大鼠與人類的大腦結(jié)構(gòu)相似，能很好地模擬人腦缺血缺氧的過程。觀察氫飽和的生理鹽水(簡稱為富氫水)對(duì)急性CO中毒腦損傷大鼠的保護(hù)效應(yīng)，通過癥狀學(xué)、病理學(xué)、形態(tài)學(xué)、行為學(xué)等不同指標(biāo)分別評(píng)價(jià)富氫水對(duì)皮層區(qū)以及海馬區(qū)的保護(hù)效應(yīng)。并從兩方面探討富氫水對(duì)急性CO中毒腦損傷保護(hù)作用的機(jī)制：(1)富氫水治療對(duì)大鼠急性CO中毒后氧自由基及相關(guān)抗氧化酶的作用。主要觀察急性CO中毒后腹腔注射富氫水，大鼠大腦皮層

4、和海馬的氧化應(yīng)激系統(tǒng)的變化；(2)急性CO中毒后予以富氫水治療對(duì)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，并測定凋亡酶活性和凋亡相關(guān)蛋白變化。通過本課題的實(shí)施，旨在為富氫水用于臨床治療急性CO中毒腦損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、富氫水對(duì)大鼠急性CO中毒腦損傷的保護(hù)效應(yīng)
　　 目的：研究腹腔注射富氫水對(duì)大鼠急性CO中毒腦損傷是否具有保護(hù)效應(yīng)；同時(shí)分別觀察皮層和海馬對(duì)富氫水治療的反應(yīng)。
　　 方法：采用吸入法制作急性CO中毒模型，腹

5、腔注射富氫水治療。動(dòng)物分為正常對(duì)照組(Control)、CO+生理鹽水(NS)組、CO+富氫水(Hydrogen)組。造模后24小時(shí)觀察各組動(dòng)物的一般精神行為狀態(tài)、體重變化，14天生存情況，根據(jù)Brailowsky描述的神經(jīng)學(xué)評(píng)分方法對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行癥狀評(píng)估，測定腦組織含水量，采用腦組織灌流切片，行HE、NISSL染色，并在鏡下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。觀察建模后存活14天大鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其空間記憶能力。
　　 結(jié)果：富氫水治

6、療組的動(dòng)物在建模后24小時(shí)精神狀態(tài)較好，毛色光滑，較為活潑，反應(yīng)迅速，主動(dòng)攝入食水，體重下降不明顯，其結(jié)果明顯優(yōu)于生理鹽水組(14.17±3.76gvs.18.5±2.43g；P<0.05)；富氫水治療組的生存率明顯增高(80％vs.60％；P<0.05)；神經(jīng)功能缺失癥狀減輕明顯(13.83±1.94vs.16.83±1.72；P<0.05)；腦組織水含量低(0.79±0.04vs.0.88±0.04；P<0.01)。HE和NISSL

7、染色均表明富氫水對(duì)皮層(NISSL：88.50±22.88vs.58.67±16.18；P<0.05)和海馬(NISSL：102.83±26.36vs.51.67±16.79，P<0.01)有明顯的保護(hù)作用。2周后水迷宮測試提示富氫水治療組逃避潛伏期短于生理鹽水組(22.67±4.03vs.32.33±4.59，P<0.05)。
　　 結(jié)論：1、吸入法模擬急性CO中毒模型制作方法相對(duì)簡單，重復(fù)性好，能比較好地應(yīng)用于觀察動(dòng)物急性C

8、O中毒后各項(xiàng)指標(biāo)的變化以及干預(yù)措施的療效比較；2、富氫水注射對(duì)大鼠急性CO中毒腦損傷有保護(hù)作用。
　　 二、富氫水通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激系統(tǒng)對(duì)大鼠急性CO中毒腦損傷的保護(hù)作用
　　 目的：研究富氫水的保護(hù)效應(yīng)是否與清除氧自由基、上調(diào)抗氧化酶的活性有關(guān)。
　　 方法：按照第一部分的方法進(jìn)行建模和治療。對(duì)大鼠皮層和海馬分別取材，制作組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明用硫代巴比妥酸法(TBA)測定丙二醛(MDA)含量，酶聯(lián)免疫吸附測試

9、法(ELISA)測定8-羥基鳥嘌呤(8-OHdG)含量，羥胺法測定超氧化物歧化酶(SOD)活力，比色法測定腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活力。
　　 結(jié)果：CO中毒后24小時(shí)，與生理鹽水組相比，富氫水能降低皮層(1.42±0.44vs.2.04±0.44，P<0.05)和海馬(1.91±0.68vs.3.17±0.69，P<0.01)的MDA含量；降低8-OHdG的含量(皮層54.64±4.93vs.62.98±9.

10、08，P<0.05)；海馬60.43±10.49vs.82.66±12.55，P<0.01)；增強(qiáng)抗氧化酶的活性，如SOD(皮層111.35±44.95vs.46.23±28.78，P<0.05；海馬173.08±51.43vs.89.11±35.38，P<0.01)，但對(duì)GSH-px影響不明顯(皮層5.41±1.41vs.5.25±0.89，P>0.05；海馬6.19±2.67vs.5.87±2.38，P>0.05)。
　　

11、結(jié)論：1、大腦皮層和海馬對(duì)急性CO中毒均有明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)；2、富氫水的保護(hù)作用可能是通過上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶、清除氧自由基發(fā)揮作用。
　　 三、富氫水通過抑制過度凋亡對(duì)急性CO中毒腦損傷的保護(hù)作用
　　 目的：研究富氫水的保護(hù)效應(yīng)是否與抑制神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。
　　 方法：按照第一部分的方法進(jìn)行建模和治療。采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；ELISA法檢測caspase-3和caspase-9的酶活性；Weste

12、rnBlot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：CO中毒后24小時(shí)，與生理鹽水組相比，富氫水能明顯減少皮層(57.67±7.58vs.99.50±8.73，P<0.01)和海馬區(qū)(52.33±13.17vs.82.17±15.79)的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)；降低皮層和海馬的caspase-3酶(皮層0.029±0.008vs.0.065±0.009，P<0.01vs.CO+NSgroup；海馬0.031±0.004vs.0.

13、053±0.007，P<0.01)和caspase-9酶(皮層1.196±0.384vs.1.797±0.432，P<0.01；海馬1.208±0.112vs.1.897±0.280,P<0.01)相對(duì)活性；也提高了Bcl-2在皮層以及海馬(皮層1.363±0.183vs.0.886±0.070,P<0.01；海馬1.166±0.139vs.0.807±0.067，P<0.01)的表達(dá)，但對(duì)Bax水平影響不明顯(皮層0.515±0.03