靜電紡絲技術(shù)制備的聚乳酸-羥基乙酸-介孔氧化硅人工骨支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：臨床上很多骨創(chuàng)傷疾病或腫瘤會導(dǎo)致局部骨缺損甚至大段骨缺損，例如，跟骨塌陷性骨折、脛骨平臺壓縮性骨折等常會引起局部骨缺損，以及腫瘤切除術(shù)后大段骨缺損、開放性骨折感染清創(chuàng)術(shù)后、或慢性骨髓炎截除死骨后常導(dǎo)致大段骨缺損。目前，臨床上治愈骨缺損的方法基本是通過自體骨移植（金標(biāo)準(zhǔn)）或者異體骨移植實(shí)現(xiàn)。然而，上述療法各有不足，一個人的自體骨可取的總量有限，無法滿足大量植骨或大段骨缺損的修復(fù);異體骨雖然來源廣泛，但價格昂貴，且雖經(jīng)減少抗原的處理，

2、但仍有少數(shù)患者發(fā)生排斥反應(yīng)，且植入體內(nèi)后有可能會出現(xiàn)吸收，骨愈合時間通常也比自體骨移植要長。國內(nèi)每年需行骨替代物移植的病人在逐年增加，隨著交通工具的多樣化，以及建筑和制造業(yè)的發(fā)展，人們受傷后的健康意識也不斷提高，需行骨移植的病人數(shù)量越來越龐大。因此，利用組織工程技術(shù)構(gòu)建出成骨活性及生物相容性良好的骨移植替代物將有巨大的社會意義和極大的應(yīng)用前景。加快對新型人工骨的研究不僅可以給患者提供經(jīng)濟(jì)、安全、充足的植骨替代材料，而且有望切實(shí)地攻克臨床

3、病人大量骨缺損修復(fù)的棘手問題。
　　目的：本研究利用靜電紡絲技術(shù)，將聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)與介孔氧化硅(SBA-15，介孔分子篩的一種)進(jìn)行復(fù)合制備出聚乳酸-羥基乙酸/介孔氧化硅復(fù)合物支架。通過對這種復(fù)合物支架的表面形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)、體外生物相容性、成骨活性進(jìn)行相關(guān)檢測與分析，驗(yàn)證聚乳酸-羥基乙酸/介孔氧化硅人工骨支架的生物活性，為骨缺損修復(fù)提供一種良好的新型人工骨支架材料。
　　研究方法：利用三嵌段聚合物表面活性劑制備

4、出SBA-15粉末，通過透射電鏡(TEM)和小角度X線衍射(SAXRD)檢測SBA-15樣本的表面形態(tài)及孔徑分布，利用BET法/BJH法測定SBA-15的比表面積，孔體積。將SBA-15粉末與PLGA按不同的質(zhì)量比混合，在靜電紡絲機(jī)器上制備出PLGA/SBA-15復(fù)合物支架及純PLGA支架;使用掃描電鏡(SEM)分別對制備出的SBA-15含量不同的四組人工骨支架進(jìn)行觀察，觀察內(nèi)容有:①表面形態(tài)學(xué)、②微觀孔隙結(jié)構(gòu);使用水接觸角測試儀及能譜

5、儀(EDS)分別對制備出的4組人工骨支架進(jìn)行測試，測試內(nèi)容有:①材料親水性、②Si元素分布;利用ELISA試劑盒測定各支架對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)的吸附量和緩釋量;通過細(xì)胞核染色、螢光染色、細(xì)胞骨架染色及掃描電鏡評估細(xì)胞生長活力、形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞粘附測定、細(xì)胞增殖率測定等，驗(yàn)證PLGA/SBA-15復(fù)合物支架的生物相容性;分別將4組支架浸泡在模擬體液（SBF溶液）中，觀察其生物礦化作用，并通過茜素紅染色觀察支架上鈣鹽

6、沉積情況;分別對四組支架上的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性分析，觀察支架的成骨誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)果：電鏡下可見合成的SBA-15樣本具有規(guī)則分布的均勻孔結(jié)構(gòu)，其孔徑大小約為(6nm)，小角度X線衍射結(jié)果驗(yàn)證了我們合成的SBA-15有較高的純度。BET法分析結(jié)果表明所合成的SBA-15具有較大的比表面積及比體積，分別為732m2/g和1.2cm3/g。
　　PLGA/SBA-15復(fù)合物支架的掃描電鏡結(jié)果表明:這些支架的纖維

7、間相互交錯，形成無規(guī)則的毛氈樣和串珠樣結(jié)構(gòu);隨著支架中SBA-15含量的增加，支架形成了直徑較均勻、無規(guī)則分布的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和相互連通的三維孔道。各支架的水接觸角結(jié)果顯示:隨著支架中SBA-15百分比的提高，其水接觸角在一定范圍內(nèi)有所降低，表明SBA-15的加入在一定范圍內(nèi)提高了支架的親水性。能譜分析可見PLGA/10％SBA-15支架中Si元素含量明顯高于其他支架，且各支架中硅元素呈均勻分布，表明各支架中SBA-15呈均勻分布。在SB

8、F溶液中浸泡7天后，各支架表面都被層狀或塊狀的磷灰石覆蓋，與純PLGA支架相比，PLGA/2.5％SBA-15、PLGA/5％SBA-15、PLGA/10％SBA-15支架表面覆蓋有更多的磷灰石，且PLGA/10％SBA-15支架表面形成了更加均勻分布的層狀磷灰石，表明SBA-15的加入提高了支架的生物礦化作用。支架上rhBMP-2吸附量的ELISA結(jié)果表明PLGA/2.5％SBA-15、PLGA/5％SBA-15、PLGA/10％SB

9、A-15支架比純PLGA支架有更高的rhBMP-2吸附量，其中10％SBA-15支架的rhBMP-2吸附量最高，表明SBA-15的加入提高了支架對rhBMP-2的吸附量;同時PLGA/2.5％SBA-15、PLGA/5％SBA-15、PLGA/10％SBA-15支架比純PLGA支架的rhBMP-2釋放速率更緩慢持久，其中PLGA/10％SBA-15支架的rhBMP-2釋放速率最緩慢，表明SBA-15的加入使支架對rhBMP-2的緩釋效果

10、得到提高。細(xì)胞核DAPI染色的熒光顯微鏡結(jié)果可以看出各組支架中細(xì)胞均存活良好，其中PLGA/10％SBA-15支架上有比較高的細(xì)胞密度，說明SBA-15的加入有利于hMSCs細(xì)胞在支架上增殖。檢測細(xì)胞活力的MTT結(jié)果表明:各支架上的細(xì)胞在培養(yǎng)1天和3天后沒有明顯不同，但是培養(yǎng)7天后，PLGA/10％SBA-15支架上的細(xì)胞數(shù)量多于純PLGA支架，表明SBA-15的加入有利于hMSCs在支架上增殖。通過掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的形態(tài)和鋪展

11、，細(xì)胞在支架上培養(yǎng)3h時，可以看到純PLGA支架上的細(xì)胞形態(tài)為類圓形，而加入SBA-15的各支架上有更多的拉長形細(xì)胞;細(xì)胞在支架上培養(yǎng)24h時，與純PLGA支架相比，PLGA/SBA-15復(fù)合物支架有更大范圍的鋪展和更多扁平拉伸狀細(xì)胞，其中PLGA/10％SBA-15表現(xiàn)出較好的細(xì)胞粘附和鋪展。鋪展于PLGA及PLGA/SBA-15支架上細(xì)胞的肌動蛋白微絲在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出無規(guī)則的多邊形，表明細(xì)胞在支架表面有很好的鋪展，其中PLGA/

12、10％SBA-15支架上的細(xì)胞比純PLGA支架上的細(xì)胞數(shù)量更多，表現(xiàn)出更多的有偽足狀形態(tài)的細(xì)胞，表明SBA-15的加入提高了支架對細(xì)胞的吸附力，并有利于細(xì)胞在支架上的粘附和鋪展。Live/Dead染色結(jié)果中可觀察到加入SBA-15的支架比純PLGA支架上有更多的存活細(xì)胞，其中PLGA/10％SBA-1S支架上的細(xì)胞存活較良好，并在培養(yǎng)過程中維持一種成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)，表明制備的PLGA/SBA-15支架無細(xì)胞毒性。細(xì)胞培養(yǎng)的ALP染色結(jié)

13、果可以看出:第7天時各組支架ALP活性較低，第14天時，可以看到各支架中ALP濃度比之前有明顯提高，其中PLGA/10％SBA-15支架的堿性磷酸酶濃度要高于純PLGA組，表明SBA-15的加入有利于hMSCs向成骨細(xì)胞的分化及成骨誘導(dǎo)作用。吸附了rhBMP-2的PLGA/10％SBA-15支架的ALP活力相對于空白對照組及純PLGA組有明顯的升高。在細(xì)胞培養(yǎng)14天時，未吸附rhBMP-2的PLGA/10％SBA-15支架的ALP濃度檢

14、測較第4天和第7天的ALP濃度有所提高;吸附了rhBMP-2的各組支架的ALP濃度比之前有明顯的提高，表明加入了SBA-15的復(fù)合物支架有利于hMSCs向成骨細(xì)胞的分化，并有利于rhBMP-2的緩釋，從而加強(qiáng)支架的成骨誘導(dǎo)作用。茜素紅染色結(jié)果可以看到PLGA/SBA-15復(fù)合物支架比純PLGA支架有更濃密的鈣結(jié)節(jié)分布，表明SBA-15的加入有利于鈣鹽的沉積和支架的生物礦化作用。
　　結(jié)論：成功制備了具有較高純度及較大比表面積的SB

15、A-15，并利用靜電紡絲技術(shù)成功制備了各種PLGA/SBA-15復(fù)合物支架。SBA-15在這種復(fù)合物支架中均勻分布。這種支架具有相互貫通的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種相互連通的孔道結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞的生長和鋪展。SBA-15的加入在一定程度上提高了支架的親水性，并有利于支架對rhBMP-2的吸附和緩釋作用，從而進(jìn)一步加強(qiáng)支架的成骨誘導(dǎo)作用。種植在這種復(fù)合物支架上的細(xì)胞表現(xiàn)出良好的增殖和粘附，表明這種支架無毒、有很好的生物相容性。PLGA/SBA-15