天麻素對海人酸干預(yù)的神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的和背景:自90年代科學(xué)家們分離、培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)以來,人們相繼從各種動物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central neural system,CNS)內(nèi)分離、培養(yǎng)出了神經(jīng)干細(xì)胞,因其具有很強的分裂、增殖及自我更新能力,從而打破了傳統(tǒng)上認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞不能再生的觀念。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)對神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病等的治療以及深入研究動物的生長發(fā)育和分化具有重要的意義,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能重建提供

2、了新的手段,具有廣闊的應(yīng)用前景,因而神經(jīng)干細(xì)胞的研究也就成了當(dāng)今生命科學(xué)的研究熱點。從神經(jīng)干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究,到移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,都取得了可喜的成績。但中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生是一個十分復(fù)雜的課題,神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)如何分化也是個難題,尚存在大量的未知問題需要進(jìn)一步深入研究。缺氧缺血性腦病是臨床常見病、多發(fā)病,如腦血栓、腦梗塞、腦血管痙攣等,其致死和致殘率很高。缺氧缺血性腦病也常發(fā)生于圍產(chǎn)期的胎兒和新生兒,不僅可引起

3、患兒死亡,而且是造成腦癱、癲癇及智力發(fā)育遲緩或智力低下的重要原因。據(jù)統(tǒng)計,國內(nèi)每年約有75萬新生兒發(fā)生窒息,約有25萬嬰兒因此成為傷殘兒或低智兒童。
　　近年來的研究表明:缺血再灌注可導(dǎo)致腦內(nèi)興奮性氨基酸(EAA)的大量釋放,并對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生興奮性毒性作用,興奮性氨基酸的毒性作用可能是通過以下兩條途徑產(chǎn)生:一是主要由氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA-R)和海人藻酸受體(KA-R)過度興奮所介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞急性滲

4、透性腫脹,以Na+內(nèi)流為特征,可在數(shù)小時內(nèi)發(fā)生;二是主要由N-甲基-D-天(門)冬氨酸受體(NMDA-R)過度興奮所介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞延遲性損傷,以Ca2+內(nèi)流為特征,可在數(shù)小時至數(shù)日后發(fā)生,細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載可能是興奮性氨基酸引起細(xì)胞損傷或死亡的共同病理學(xué)機制。興奮性氨基酸受體過度興奮可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞急性滲透性腫脹或延遲性損傷,可能導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損、智能落后、姿勢異常等后遺癥。因此,本研究旨在觀察天麻素在腦缺血后興奮性氨基酸增多時的作用,研究

5、其在神經(jīng)干細(xì)胞分化中的影響,是否可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,改善腦缺氧后由于神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化導(dǎo)致的認(rèn)知或肢體活動障礙,這對于研究如何誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞在缺血缺氧后向神經(jīng)元分化,研究其在缺血性腦血管病、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、癲癇、神經(jīng)損傷等疾病中的應(yīng)用具有重要意義。
　　材料與方法:以新生24h內(nèi)的Wistar大鼠為實驗動物,體外分離并培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,傳代培養(yǎng),并進(jìn)行細(xì)胞單克隆實驗。在神經(jīng)干細(xì)胞分化時加海人酸和天麻素干預(yù),海人

6、酸濃度分別為100μmol/l、500μmol/l、1mmol/l、2mmol/l、5mmol/l,天麻素濃度為0.5mg/l。免疫熒光法和免疫組化SP法檢測加入海人酸和天麻素干預(yù)后神經(jīng)干細(xì)胞分化后細(xì)胞比例的變化,AO/EB熒光雙染檢測加入海人酸后部分神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡,MTT比色法測定海人酸對神經(jīng)干細(xì)胞分化速度的影響。
　　結(jié)果:1.神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,其比例為23.07％±1.51％和76.93％±1.51％。

7、
　　2.KA干預(yù)組神經(jīng)元和膠質(zhì)陽性細(xì)胞比例分別為13.99％±2.07％和86.01％±2.07％。不同濃度的海人酸干預(yù)的組之間神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞比例無明顯差異(F=1.43,p>0.05),正常分化組與KA干預(yù)組所分化細(xì)胞比例有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(F=368.21,p<0.001),海人酸可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　3.海人酸和天麻素干預(yù)組神經(jīng)元和膠質(zhì)陽性細(xì)胞比例分別約為17.16％±2.14％和82.84％±2.

8、14％,與只加海人酸組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=115.6,p<0.01),天麻素可可在一定程度上減少海人酸興奮性的影響,誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
　　4.MTT檢測加入海人酸和天麻素后早期部分神經(jīng)干細(xì)胞死亡,但可促進(jìn)存活的神經(jīng)干細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:1.本實驗所分離細(xì)胞的可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,是神經(jīng)干細(xì)胞。
　　2.海人酸可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　3.天麻素可在一定程度上