重組β-防御素-2對大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、防御素是20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于植物、昆蟲、兩棲動物、鳥類以及哺乳動物中的一類小分子陽離子抗菌肽,分子量約4kD至5kD,它們具有廣泛的抗菌譜,參與了機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫,對免疫細(xì)胞具有趨化作用.根據(jù)空間結(jié)構(gòu)的不同,分為α-和β-防御素兩個(gè)家族.由于防御素獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、作用方式及其免疫調(diào)節(jié)作用,防御素家族已經(jīng)引起國際學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注,它們在體內(nèi)的表達(dá)方式、生理功能、作用機(jī)理、協(xié)同作用及家族新成員的相繼發(fā)現(xiàn)等均已成為該領(lǐng)域的

2、研究熱點(diǎn).然而,目前關(guān)于防御素的生物學(xué)功能的研究大部分在體外進(jìn)行,這些研究只有轉(zhuǎn)化為動物模型的體內(nèi)研究后,才能更為準(zhǔn)確的反映防御素在人類疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用.β-防御素-2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的在表皮和肺上皮細(xì)胞中呈誘導(dǎo)型表達(dá)的抗菌肽,資料表明其表達(dá)水平異常或生物活性受損與某些呼吸系統(tǒng)疾病,如先天性肺囊性纖維化及全身性感染患者肺部感染的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).這提示它可能通過對病原微生物的直接殺傷或是對炎癥過程的調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用.然而迄今為止,β-

3、防御素-2在肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制仍未明了.由于肺的解剖位置的特殊性,肺在炎癥反應(yīng)過程中的重要作用,以及防御素在肺組織的豐富表達(dá),肺成為研究防御素作用的最重要的臟器和模型.急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)功能失常,感染、膿毒癥、創(chuàng)傷都可導(dǎo)致ALI的發(fā)生,其嚴(yán)重形式即急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)死亡率高達(dá)30﹪-50

4、﹪.隨著機(jī)械通氣的運(yùn)用、監(jiān)護(hù)及營養(yǎng)條件的改善,ARDS患者的死亡率有所下降,但仍是危重病患者一個(gè)主要的死亡原因,尤其是膿毒癥所致的.ARDS,如何促進(jìn)和改善ALI/ARDS的預(yù)后是臨床上的研究熱點(diǎn).本文擬通過轉(zhuǎn)基因的方法,實(shí)現(xiàn)重組β-防御素-2在肺部的表達(dá),進(jìn)行相關(guān)肺損傷保護(hù)作用的研究.如何采用合適的表達(dá)系統(tǒng),在高表達(dá)的同時(shí)充分保持抗菌肽的生物學(xué)活性已成為研究的關(guān)鍵.腺病毒載體作為廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)之一,能有效感染哺乳動物細(xì)胞,具有高效

5、傳遞和表達(dá)基因的能力,利用腺病毒載體系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行抗菌肽的表達(dá)目前尚未見報(bào)道.本文將以人p.防御素.2(hBD2)的同源體--大鼠β-防御素-2(rBD2)為研究對象,分為①構(gòu)建攜帶rBD-2基因的重組腺病毒表達(dá)載體、②重組rBD2對綠膿桿菌感染致急性肺損傷的保護(hù)作用研究、③重組rBD2對膿毒癥所致急性肺損傷的保護(hù)作用研究三個(gè)部分,探討應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)獲得重組rBD2在大鼠肺部表達(dá)的可行性、了解重組rBD2在綠膿桿菌感染及膿

6、毒癥所致急性肺損傷、肺功能障礙發(fā)生發(fā)展中的作用,以圖闡明防御素在體內(nèi)的生理功能及其作用機(jī)理,也可為研究防御素在相關(guān)疾病中的作用提供理論依據(jù). 第一部分:重組β-防御素-2基因腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與真核表達(dá) 研究目的:探討重組腺病毒載體在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)陽離子抗菌肽--β-防御素-2的可行性. 研究方法:采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到大鼠β-防御素-2(rBD2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-

7、CMV中,重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-rBD2轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183-AD-1后,與腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1發(fā)生同源重組,重組質(zhì)粒pAdEasy-rBD2轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒表達(dá)載體的包裝.將包裝成功的腺病毒Ad-rBD2感染COS-7細(xì)胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,進(jìn)行β-防御素-2多肽的體外和體內(nèi)表達(dá),采用Western blot與免疫組化方法檢測其表達(dá).同法構(gòu)建對照腺病毒載體Ad-LacZ.

8、 結(jié)論:利用腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行β-防御素-2的轉(zhuǎn)基因研究具有可行性,構(gòu)建的重組腺病毒載體在體外、體內(nèi)都能夠表達(dá)目標(biāo)蛋白. 第二部分:重組β-防御素-2對大鼠呼吸道綠膿桿菌感染急性肺損傷的保護(hù)作用 研究目的:探討重組β-防御素-2對大鼠呼吸道綠膿桿菌感染急性肺損傷的保護(hù)作用. 研究方法:清潔級健康SD雄性大鼠12只,隨機(jī)分為兩組,Ad-rBD2組(實(shí)驗(yàn)組)及Ad-LacZ組(對照組)各6只.均予以氯胺酮7 m

9、g/100g腹腔注射麻醉后,行氣管插管,分別氣道滴注Ad-rBD2(10<'7>PFU)及Ad-LacZ(10<'7>PFU).48小時(shí)后全部大鼠經(jīng)氣道滴注200 μl的6×10<'8>CFU/ml(菌落數(shù)/毫升)綠膿桿菌ATCC27853,建立綠膿桿菌感染后肺損傷模型.氣道給予綠膿桿菌24小時(shí)后處死大鼠,采集肺泡灌洗液行肺細(xì)菌清除率測定和白細(xì)胞計(jì)數(shù);取肺組織觀察其病理變化.結(jié)果與對照組相比,Ad-rBD2組肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低

10、(p<0.05),細(xì)菌清除率增高(P<0.05),肺組織中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞滲出減少、肺泡結(jié)構(gòu)仍保持完整、間質(zhì)水腫減輕. 結(jié)論:重組β-防御素-2具有體內(nèi)殺菌活性,對呼吸道綠膿桿菌感染大鼠肺損傷的發(fā)生、發(fā)展具有保護(hù)作用。 第三部分:重組β-防御素-2對大鼠膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用 目的:探討重組β-防御素-2對大鼠膿毒癥致急性肺損傷的保護(hù)作用以及對預(yù)后的影響. 研究方法 SD大鼠84只隨機(jī)分為兩組, A

11、d-rBD2組(實(shí)驗(yàn)組)及Ad-LacZ組(對照組)各42只.均予以氯胺酮7 mg/100g腹腔注射麻醉后,行氣管插管,分別氣道滴注Ad-rBD2(10M<'7>PFU)及Ad-LacZ(10<'7>PFU).48h后行盲腸結(jié)扎穿孔,建立膿毒癥模型.于模型完成后Oh,12h,24h,36h,72h處死大鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=12,實(shí)驗(yàn)組、對照組各6只),取肺及腹腔灌洗液,行灌洗液細(xì)菌計(jì)數(shù)、肺組織常規(guī)病理切片觀察、肺組織細(xì)胞凋亡電鏡及TUNE