日本血吸蟲(chóng)神經(jīng)遞質(zhì)章魚(yú)胺受體(SjOAR)和延伸因子(SjEF)的鑒定及特性研究.pdf

1、日本血吸蟲(chóng)?。╯chistosomiasis）在我國(guó)南方是一種廣泛分布和嚴(yán)重危害人民身體健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病。目前主要的防制措施是控制傳染源，其中以吡喹酮治療帶蟲(chóng)宿主是重要的環(huán)節(jié)。但實(shí)踐表明化療不能根除血吸蟲(chóng)病，包括吡喹酮，亦不能防止血吸蟲(chóng)病的再感染，特別是反復(fù)感染后長(zhǎng)期用藥，可能會(huì)引起產(chǎn)生耐藥性的危險(xiǎn)，因此加強(qiáng)對(duì)新抗蟲(chóng)藥物及疫苗的研究開(kāi)發(fā)是當(dāng)前血吸蟲(chóng)病防控研究的重要方向。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組研究的結(jié)果，選擇日本血吸蟲(chóng)章魚(yú)胺受體

2、（octopamine recptor,OAR）和蛋白質(zhì)合成延伸因子（elongation factors,EF）基因，分析了其在日本血吸蟲(chóng)中的特性，在大腸桿菌中表達(dá)了重組蛋白并純化得到了具有較高抗原性的融合蛋白，在小鼠日本血吸蟲(chóng)病模型中評(píng)估了其的保護(hù)效果，研究了免疫保護(hù)機(jī)制。并利用抑制藥物觀察了章魚(yú)胺受體在血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。
　　1.日本血吸蟲(chóng)神經(jīng)受體OAR的特性研究
　　利用 PCR克隆了日本血吸蟲(chóng) OAR的 cD

3、NA，序列分析顯示 SjOAR共1422bp，編碼474個(gè)氨基酸。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR分析日本血吸蟲(chóng)7、14、21、28d童蟲(chóng)和35、42d成蟲(chóng)及42d雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的SjOAR轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示章魚(yú)胺受體基因在日本血吸蟲(chóng)各期童蟲(chóng)和成蟲(chóng)中轉(zhuǎn)錄差異不大，28d童蟲(chóng)表達(dá)量較高，雌蟲(chóng)表達(dá)量比雄蟲(chóng)高。根據(jù)抗原性和保守性分析結(jié)果，選擇其中一段261bp的序列，成功地構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒SjOAR-pET-32a，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)并純

4、化到重組蛋白，分子量為32kD，Western blotting分析表明該重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性。應(yīng)用SjOAR-pET-32a重組蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化和免疫熒光技術(shù)對(duì)該蛋白的表達(dá)部位進(jìn)行分析，結(jié)果顯示章魚(yú)胺受體在日本血吸蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)量比較低，在日本血吸蟲(chóng)緊鄰表膜附近以及生殖系統(tǒng)中分布較多，其它組織部分分布較少。
　　用純化的SjOAR-pET-32a重組蛋白免疫BALB/c小鼠進(jìn)行小鼠日本血吸蟲(chóng)病免

5、疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果與空白對(duì)照組相比，重組蛋白 SjOAR-pET-32a誘導(dǎo)了28.12％的減蟲(chóng)率和38.20%的肝臟減卵率，差異極顯著（p<0.01）。重組蛋白在三次免疫小鼠后均誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的特異性IgG抗體。免疫機(jī)制研究表明，該蛋白誘導(dǎo)了小鼠Th1和Th2混合的免疫反應(yīng)。應(yīng)用章魚(yú)胺受體抑制藥物進(jìn)行的小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，與PBS對(duì)照組相比，尾靜脈注射cis(Z)-flupenxio組獲得了30.90%的減蟲(chóng)率，47.31%的肝臟減

6、卵率，差異極顯著（P﹤0.01）；25d cis(Z)-flupenxio組獲得了15.49%的減蟲(chóng)率，49.95%的肝臟減卵率，差異極顯著（P﹤0.01）；Mianserin組獲得了20.27%的減蟲(chóng)率，28.87%的肝臟減卵率，差異不顯著（P﹥0.05）。結(jié)果表明日本血吸蟲(chóng)章魚(yú)胺受體有作為抗血吸蟲(chóng)藥物研究靶標(biāo)的潛力。
　　2.日本血吸蟲(chóng)EF的克隆表達(dá)及免疫保護(hù)的初步評(píng)估
　　應(yīng)用PCR克隆了日本血吸蟲(chóng)延伸因子的基因片段，

7、大小為642bp，包含整個(gè)ORF。通過(guò)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析，推測(cè)該基因可能為EF-β型基因。成功地構(gòu)建了含SjEF的重組表達(dá)質(zhì)粒SjEF-pET-28a，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化并制備了多克隆抗體。Western blotting分析表明該重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性。免疫組化分析顯示SjEF主要分布在日本血吸蟲(chóng)表膜和實(shí)質(zhì)部分，在肌肉組織中分布均勻。用該重組蛋白免疫小鼠后，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體。進(jìn)一步測(cè)定三次免疫后抗