pc-CPC和p-BG的制備及在骨組織工程中的應(yīng)用研究.pdf

1、組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法來(lái)認(rèn)識(shí)正常或病理狀態(tài)下的哺乳類(lèi)組織的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并研制生物性替代物以恢復(fù)、維持或改善其功能。它的確立和發(fā)展有賴(lài)于組織培養(yǎng)、材料科學(xué)及器官移植學(xué)的進(jìn)步，是在生物材料學(xué)同生物活性物質(zhì)相結(jié)合，通過(guò)與機(jī)體相互作用而促進(jìn)組織修復(fù)的基礎(chǔ)上形成的交叉學(xué)科?？谇会t(yī)學(xué)領(lǐng)域的組織工程是人體組織工程學(xué)研究一個(gè)重要組成部分。其中下頜骨缺損的修復(fù)是目前口腔組織工程的研究熱點(diǎn)。目前研究主要包括：①種子

2、細(xì)胞的體外培養(yǎng);②細(xì)胞種植基質(zhì)材料即支架材料的研究開(kāi)發(fā);③組織培養(yǎng)中各種因子的調(diào)控作用。作為種子細(xì)胞種植的基質(zhì)，支架材料發(fā)揮著重要的作用，也是目前骨組織工程的研究重點(diǎn)。在本課題中，我們以無(wú)機(jī)材料CPC和A/W生物玻璃為基礎(chǔ)，通過(guò)控制其孔徑、孔隙率和Ca/P比和加入碳酸鹽等途徑制備出具有較大孔隙率和孔徑尺寸的多孔碳酸磷酸鈣骨水泥(porous carbonate calcium phosphate cement，pc-CPC)和

3、多孔生物玻璃(porous bioactive glass，p-BG)，探討其是否適合作為骨組織工程的支架材料進(jìn)行兔下頜骨的修復(fù)。目的制備pc-CPC和p-BG，使其具有良好的仿生性，可控的孔隙率、孔徑尺寸和降解率。研究這兩種材料對(duì)成骨細(xì)胞的細(xì)胞相容性和作為骨組織工程的支架材料加速兔下頜骨缺損修復(fù)過(guò)程的可行性。方法(1）pc-CPC的制備。將磷酸四鈣和無(wú)水磷酸氫鈣粉末不同摩爾比混合均勻得到CPC粉。將CPC和碳酸納粉末按一定

4、比例混合均勻，并將其與石蠟(粒徑為400 μ m～500μm)和固化液體按一定比例混合，制模后經(jīng)固化、溶去致孔劑、干燥后獲得具有不同鈣磷比、孔隙率和碳酸根含量的pc-CPC。進(jìn)行孔隙率、掃描電鏡、抗壓強(qiáng)度、降解率等檢測(cè)。(2)p-BG的制備。以A/W高強(qiáng)度致密生物活性玻璃陶瓷材料組成為基礎(chǔ)，通過(guò)采用添加受壓產(chǎn)生塑性變性的塑性成孔劑制備p-BG。對(duì)所制備的材料進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)和形貌分析，孔隙率和抗壓強(qiáng)度的測(cè)定。(3)兔骨髓基質(zhì)干

5、細(xì)胞的原代誘導(dǎo)培養(yǎng)。診斷試劑抽取兔的骨髓，選擇較為經(jīng)典的貼壁篩選法，原代培養(yǎng)BMSCs。然后在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化而成成骨細(xì)胞。并對(duì)其進(jìn)行倒置相差顯微鏡觀察，堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)鑒定和生長(zhǎng)曲線的繪制。(4)p-BG和pc-CPC體外細(xì)胞相容性研究。診斷試劑利用兩種材料的浸提液對(duì)BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)其對(duì)BMSCs增殖活性、ALP活性、細(xì)胞周期、I型膠原表達(dá)的影響。并將細(xì)胞和兩種多孔材料復(fù)合，形成pc-CPC/cell和p

6、-BG/cell，掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的粘附和生長(zhǎng)狀況。(5)p-BG和pc-CPC作為骨組織工程支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。pc-CPC、p-BG、pc-CPC/cell、p-BG/cell四組，每組6個(gè)樣本，分別雙側(cè)植入大小為1cm× 0.6cm×O.3cm的兔下頜骨缺損中，術(shù)后2、4、8周對(duì)植入部位進(jìn)行大體觀察、組織切片HE染色、Masson三色法染色和掃描電鏡觀察。結(jié)果(1）pc-CPC的制備。pc-C

7、PC孔徑可達(dá)400 μ m～500 μ m，孔分布均勻，連通率高。隨著致孔劑用量的增加，材料孔隙率增大，抗壓強(qiáng)度下降。鈣磷比降低，碳酸根含量的增加，都會(huì)導(dǎo)致材料降解速率的增加。(2)p-BG的制備。p-BG隨著致孔劑用量的增加，孔隙率增大?？紫堵孰S致孔劑含量增加而增加。樣品抗壓強(qiáng)度隨孔隙率的升高而顯著降低，成孔劑粒徑不同時(shí)，抗壓強(qiáng)度沒(méi)有顯著性改變。(3)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的原代誘導(dǎo)培養(yǎng)。利用貼壁篩選法培養(yǎng)的BMSCs鏡下觀察

8、細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)，堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，鈣結(jié)節(jié)生成，增殖狀態(tài)良好。(4)p-BG和pc-CPC體外細(xì)胞相容性研究。兩種材料的浸提液均對(duì)成骨細(xì)胞的增殖活性、堿性磷酸酶和I型膠原的分泌、細(xì)胞周期沒(méi)有不良影響，其中兩種材料的浸提液在3d時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖活性有促進(jìn)作用。細(xì)胞在兩種材料表面8h時(shí)即粘附生長(zhǎng)，完全伸展。(5)p-BG和pc-CPC作為骨組織工程支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后2w，

9、大體觀察顯示實(shí)驗(yàn)各組骨缺損處已被部分骨痂覆蓋，pc-CPC/cell和p-BG/cell兩組組骨痂面積大于pc-CPC組和p-BG組，pc-CPC已碎裂，p-BG邊緣處有破碎。組織切片觀察顯示pc-CPC組和p-BG組骨基質(zhì)主要分布在靠近原有骨的骨壁處，而pc-CPC/cell和p-BG/cell兩組骨基質(zhì)呈散在分布，膠原纖維分泌活躍。掃描電鏡結(jié)果顯示膠原纖維豐富，p-BG較pc-CPC結(jié)構(gòu)保持完好。4周時(shí)，大體觀察顯示pc-

10、CPC/cell和p-BG/cell兩組骨痂厚度大于pc-CPC組和p-BG組，pc-CPC材料破碎，只有中間部分尚呈團(tuán)塊狀，p-BG邊緣有破碎現(xiàn)象，但是中心區(qū)破碎成較大的碎塊。組織切片觀察顯示可見(jiàn)pc-CPC/cell和p-BG/cel l兩組骨基質(zhì)形成分別較pc--CPC組和p-BG組偏多，面積較2周時(shí)增加，膠原纖維豐富。掃描電鏡觀察顯示膠原纖維生成旺盛，p-BG結(jié)構(gòu)相對(duì)完好。8周時(shí)，大體觀察顯示實(shí)驗(yàn)各組骨痂基本和正常骨面

11、高度一致，硬度較大，和正常骨無(wú)明顯差異。pc-CPC剩余少量顆粒樣結(jié)構(gòu)，p-BG尚有部分塊體。組織切片觀察顯示實(shí)驗(yàn)各組骨缺損部位已大部為骨基質(zhì)占據(jù)，p-BG材料殘余較pc-CPC多，膠原纖維豐富。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膠原纖維豐富，可見(jiàn)鈣化的新骨。結(jié)論(1）對(duì)于pc-CPC而言，致孔劑用量的調(diào)整可以控制孔隙率和抗壓強(qiáng)度。材料的降解性則與鈣磷比和碳酸根含量有關(guān)。(2)p-BG宏觀孔孔徑取決于成孔劑粒徑;孔隙率和抗壓強(qiáng)度可通過(guò)改變致

12、孔劑的添加量來(lái)控制;抗壓強(qiáng)度由致孔劑的添加量決定。(3)采用貼壁篩選法對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并向成骨方向誘導(dǎo)分化而成的成骨細(xì)胞，適合作為骨組織工程的種子細(xì)胞。(4)pc-CPC和p-BG均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，適合作為細(xì)胞種植的基質(zhì)材料。(5)pc-CPC/cell和p-BG/cell復(fù)合體與pc-CPC和p-BG相比可加快骨缺損修復(fù)的進(jìn)程，促進(jìn)早期愈合。關(guān)鍵詞：磷酸鈣骨水泥 生物玻璃 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 組織工程 骨