牡蠣殼組織工程骨材料制備和Rab5在骨系分化中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨缺損和骨不連，依然是現(xiàn)今創(chuàng)傷性骨折治療中，外科整形重建所面臨最棘手的問(wèn)題之一，“自體移植”和“異體移植”理論上可以達(dá)到最佳的恢復(fù)效果，被認(rèn)為是臨床“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是上述治療方法由于內(nèi)在限制和缺陷，無(wú)法達(dá)到臨床的廣泛使用。骨移植由于來(lái)源受限，并發(fā)癥繁多，骨免疫因素等，無(wú)法大量開(kāi)展。組織工程是作為一門新興交叉學(xué)科，發(fā)展于20世紀(jì)80年代，定義如下:將工程學(xué)和的生命科學(xué)基本原理技術(shù)結(jié)合，在體外構(gòu)建具有生物功能的人工取代物，用于修復(fù)組織缺損，替

2、代失去功能或衰竭的組織、器官的部分或全部功能。由此，大量的人工骨材料被開(kāi)發(fā)出來(lái)，極佳的生物相容性和骨可替代性使得骨組織工程材料能在臨床廣泛使用。牡蠣殼等海洋生物貝殼類具有資源豐富，結(jié)構(gòu)致密，強(qiáng)度與皮質(zhì)骨相當(dāng)，其納米顆粒的形成過(guò)程于正常骨形成有相似特點(diǎn)，其中碳酸鈣(CaCO3)成分是95.994％，是一種十分有潛力的骨替代材料。如果將牡蠣殼合成并加工制作成一種組織工程骨材料，將為臨床骨缺損修復(fù)提供一種嶄新的治療手段。
　　骨質(zhì)疏松癥

3、是骨科一種常見(jiàn)的全身性骨病，以骨質(zhì)量損害，骨量減少及骨強(qiáng)度變低，最終導(dǎo)致骨脆性增加，發(fā)生脆性骨折為特性。主要的臨床表現(xiàn):周身疼痛，身高降低、發(fā)生脆性骨折、駝背以及對(duì)呼吸系統(tǒng)影響。骨質(zhì)疏松癥對(duì)現(xiàn)今醫(yī)療系統(tǒng)負(fù)擔(dān)巨大，在分子水平，骨質(zhì)疏松癥伴隨著成骨功能下降和破骨水平升高。在老年人中，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一項(xiàng)主要的健康問(wèn)題，確診之后的后續(xù)治療也是在不斷調(diào)整。對(duì)于骨質(zhì)疏松癥中，關(guān)于骨轉(zhuǎn)化和病理機(jī)制，越來(lái)越多的研究在開(kāi)展，同時(shí)也使得相應(yīng)的精確靶點(diǎn)治

4、療成為可能。Rab5作為鳥(niǎo)苷酸-5-三磷酸鹽(GTP)結(jié)合蛋白家族中的一員，在早期的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)內(nèi)吞作用過(guò)程，核內(nèi)體的細(xì)胞運(yùn)輸和成熟過(guò)程中，都起到關(guān)鍵性的作用。在人類細(xì)胞中，Rab5有三種不同的亞型存在（RAB5A，Rab5B和Rab5C）三種亞型之間存在重疊的胞內(nèi)定位和細(xì)胞內(nèi)吞功能的重疊。Rab5的主要定位于早期的內(nèi)涵體，調(diào)控細(xì)胞的融合，對(duì)接和微管運(yùn)動(dòng)。有活性的GTP結(jié)合形式下，下游效應(yīng)器（APPL1和APPL2）被結(jié)合，這次結(jié)合是區(qū)別早

5、期內(nèi)涵體和調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-運(yùn)輸貨物的重要標(biāo)志。在本次研究中，探究了Rab5蛋白參與骨系分化和骨重建過(guò)程，并在成骨骨骼生長(zhǎng)中起到關(guān)鍵作用。
　　作者博士期間從事骨組織工程材料和骨系成骨分化相關(guān)研究。已經(jīng)有多篇SCI論文發(fā)表。本課題分為四個(gè)部分:一、牡蠣殼組織工程骨材料制備和特性;二、牡蠣殼組織工程骨材料生物學(xué)研究;三、Rab5在骨系分化中的作用。四、Rab5敲降/過(guò)表達(dá)對(duì)骨系分化的影響。我們的研究表明，牡蠣殼復(fù)合硫酸鈣材料可以通過(guò)改良

6、乙醇鹽溶法成功制取，復(fù)合工程骨可彌補(bǔ)單純硫酸鈣骨誘導(dǎo)性缺乏的劣勢(shì)，早期就能形成碳化羥基磷灰石;復(fù)合材料生物相容性佳，促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨基因的表達(dá)，股骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)效果明顯;Rab5在隨著成骨分化過(guò)程表達(dá)上升，臨床骨質(zhì)疏松癥標(biāo)本證實(shí)了這一現(xiàn)象;Rab5過(guò)表達(dá)促進(jìn)成骨系分化，而siRNA敲降后抑制了成骨系分化，小鼠顱蓋骨體內(nèi)siRNA注射抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rab5在成骨發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。
　　第一部分:牡蠣殼組織工程骨制備和特性

7、>　　目的:本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖侵苽淙碌纳锝M織工程骨材料—硫酸鈣/牡蠣殼(CS/OS)。探究本材料的微觀結(jié)構(gòu)，自固化性能，物相構(gòu)成，力學(xué)特性，體外降解性和體外生物活性。
　　方法:復(fù)合材料CS/OS的制備和初步性能檢測(cè):使用乙醇鹽溶法制備組織工程骨材料—硫酸鈣/牡蠣殼。鹽溶法制備體系中包括:30％氯化鈣，0.25％的丁二酸，乙醇/水比為2∶3的水溶液。通過(guò)x射線衍射(XRD)檢測(cè)復(fù)合材料的物相信息，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)觀察復(fù)

8、合材料的微觀結(jié)構(gòu)。在加水自固化過(guò)程中，我們分別檢測(cè)各個(gè)樣品的自固化時(shí)間，并根據(jù)養(yǎng)護(hù)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)試各組力學(xué)性能差異。將不同組分工程材料放入人體模擬液(SBF)，7天后，運(yùn)用X射線衍射XRD檢測(cè)浸潤(rùn)后材料物相，使用帶有射線能譜(EDX)功能的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡FE-SEM檢測(cè)物質(zhì)形貌并進(jìn)行元素分析。將工程材料制成高3mm直徑6mm的圓柱體(Φ6mm×3mm)，放置于人體模擬液SBF中水浴，統(tǒng)計(jì)每組材料浸泡前后損失的重量。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)pH

9、值和Ca2+的濃度，對(duì)材料降解周圍的微環(huán)境進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)探究了材料的自固化性能，力學(xué)特性和體外降解速率。本實(shí)驗(yàn)得到如下的結(jié)果:相比較純半水硫酸鈣骨水泥CS，復(fù)合工程材料硫酸鈣/牡蠣殼粉CS/OS自固化時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)11-28分鐘。隨著養(yǎng)護(hù)時(shí)間的延長(zhǎng)，CS/OS工程材料力學(xué)性能在初始凝固之后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中復(fù)合工程材料CS/OS12力學(xué)性能最佳。牡蠣殼的添加使純半水硫酸鈣CS具備了體外生物活性，在人體模擬液SBF浸泡7天

10、后，CS/OS材料表面產(chǎn)生了碳素類骨羥基磷灰石，此類羥基磷灰石是最適宜人體成骨的礦物質(zhì)。另外，相比純半水硫酸鈣，復(fù)合材料CS/OS的體外降解速率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于解決臨床硫酸鈣使用過(guò)程中降解過(guò)快，具有一定的意義。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)使用乙醇鹽溶液法成功制取牡蠣殼-硫酸鈣CS/OS骨組織工程材料，制備得到的牡蠣殼工程材料相比純半水硫酸鈣具有更優(yōu)良的骨修復(fù)材料特性。表現(xiàn)在更佳的降解速率和生物活性獲得。為臨床骨修復(fù)材料制備提供了

11、一種新思路。
　　第二部分:牡蠣殼組織工程骨生物學(xué)研究
　　目的:通過(guò)使用材料的浸提液和細(xì)胞共培養(yǎng)，探究材料對(duì)體外細(xì)胞增殖和成骨分化的作用。通過(guò)股骨髁缺損模型，植入牡蠣殼組織工程骨，評(píng)價(jià)其骨修復(fù)能力。
　　方法: MG63細(xì)胞系進(jìn)行體外相容性實(shí)驗(yàn)。材料浸提液培養(yǎng)MG63細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)方法，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況并評(píng)估材料的體外相容性。并行堿性磷酸酶染色（ALP染色）和鈣結(jié)節(jié)染色（Von Kos

12、sa染色）。蛋白質(zhì)印跡分析(WB)，在7，14天時(shí)同時(shí)檢測(cè)Ⅰ型膠原(COLⅠ)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)。采用原位股骨髁缺損實(shí)驗(yàn)，來(lái)評(píng)估CS/OS復(fù)合材料的骨修復(fù)再生效果。
　　結(jié)果:細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，牡蠣殼工程材料CS/OS浸提液處理細(xì)胞組尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的毒性作用，一定濃度內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。ALP染色和Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)，牡蠣殼工程材料組顯示陽(yáng)性。兩個(gè)指標(biāo)BMP-2和COLⅠ，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析WB實(shí)驗(yàn)比較，牡蠣殼工

13、程材料組相比較單純硫酸鈣組蛋白明顯的上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。qPCR發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達(dá)在牡蠣殼材料組明顯上調(diào)，如BMP-2，Runx2，Osx，and OCN。股骨髁修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，牡蠣殼工程材料組形成的新骨，骨小梁體積更規(guī)則致密，骨髓腔清晰完整。單純硫酸鈣組新骨骨小梁稀疏。
　　結(jié)論:牡蠣殼復(fù)合工程材料具有優(yōu)良的生物相容性，可誘導(dǎo)成骨分化，同時(shí)促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白BMP-2和COLⅠ的表達(dá)。體內(nèi)骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了牡蠣殼工程材料良好的骨修復(fù)

14、能力。
　　第三部分:Rab5在骨系分化中的作用
　　目的:本研究目的旨在探究Rab5在骨質(zhì)疏松中成骨分化的作用，應(yīng)用臨床標(biāo)本和成骨細(xì)胞分化模型，觀察Rab5表達(dá)情況以及成骨相關(guān)基因動(dòng)態(tài)變化。
　　方法:收集臨床標(biāo)本，不同階段的骨質(zhì)疏松標(biāo)本，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)不同階段骨質(zhì)疏松，Rab5的表達(dá)量變化和病情是否有相關(guān)性。建立成骨分化模型后，檢測(cè)成骨相關(guān)特異性基因，1型膠原COL1，骨橋蛋白OPN，骨鈣素OCN，成骨

15、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX。并行堿性磷酸酶染色，茜素紅染色和Vonkossa染色。用免疫熒光共聚焦顯微鏡和蛋白印跡Western Blot方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Rab5含量和成骨特異性蛋白變化。
　　結(jié)果:臨床骨質(zhì)疏松病人標(biāo)本的HE病理切片顯示不同的臨床骨松階段，根據(jù)病人臨床資料，骨密度測(cè)量值Bone Mineral Density(BMD)，觀察到骨小梁規(guī)則和致密程度不同，HE病理提示骨質(zhì)疏松標(biāo)本符合實(shí)驗(yàn)要求。之后對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行

16、免疫組織化學(xué)染色，Sp7即Osterix在骨質(zhì)疏松病人中表達(dá)下降，另一方面，Rab5蛋白表達(dá)隨著骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度下調(diào)。MC3T3成骨階段性染色ALP，Alizarin Red和Vonkossa證實(shí)成骨模型成功建立。在成骨分化1，3，7，10，14，17和21天時(shí)，1型膠原COL1，骨橋蛋白OPN，骨鈣素OCN，成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX隨著成骨分化進(jìn)行上調(diào)，Rab5和其效應(yīng)蛋白APPL1、APPL2也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。免疫熒光共聚

17、焦的結(jié)果也于上述一致。
　　結(jié)論: Rab5和骨質(zhì)疏松癥存在相關(guān)性，Rab5和其效應(yīng)蛋白APPL1，APPL2的上調(diào)在MC3T3成骨分化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。
　　第四部分:Rab5的敲降/過(guò)表達(dá)對(duì)骨系分化的影響
　　目的:通過(guò)siRNA敲降Rab5表達(dá)，觀察敲降之后對(duì)成骨分化的影響。構(gòu)建Rab5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，觀察過(guò)表達(dá)Rab5對(duì)成骨分化影響。小鼠顱蓋骨內(nèi)注射siRNA，觀察Rab5抑制后對(duì)骨發(fā)育的影響。
　　方法:

18、設(shè)計(jì)siRNA，使用siRNA敲降Rab5蛋白，之后開(kāi)始成骨分化，檢測(cè)成骨相關(guān)Marker的變化，1型膠原COL1，骨橋蛋白OPN，骨鈣素OCN，成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX。并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行堿性磷酸酶染色，茜素紅染色和Vonkossa染色。構(gòu)建PXJ-40載體的Rab5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)瞬轉(zhuǎn)導(dǎo)入質(zhì)粒，觀察過(guò)表達(dá)Rab5蛋白之后，對(duì)成骨分化的影響。設(shè)計(jì)體內(nèi)siRNA，繁殖C57小鼠，對(duì)剛出生幼鼠Day2，注射siRNA并在相應(yīng)時(shí)間

19、點(diǎn)取材，使用MicroCT觀察小鼠顱蓋骨骨發(fā)育情況。并用鈣黃素進(jìn)行組織學(xué)染色，闡明在體內(nèi)Rab5被敲降之后對(duì)成骨過(guò)程和骨發(fā)育的影響。
　　結(jié)果:Rab5a、Rab5c在siRNA敲降實(shí)驗(yàn)中下降明顯，敲降之后開(kāi)始進(jìn)行成骨分化，在4，7天時(shí)，一型膠原COL1和轉(zhuǎn)錄因子Runx2下調(diào)，同時(shí)磷酸化-AKT也出現(xiàn)下調(diào)。過(guò)表達(dá)Rab5a、Rab5c質(zhì)粒，瞬轉(zhuǎn)并開(kāi)始成骨分化，OSX成骨轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)上調(diào)，一些其他的成骨指標(biāo)也維持在較高水平。敲降R

20、ab5的下游效應(yīng)蛋白APPL1、APPL2也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。7天的時(shí)候?qū)ab5過(guò)表達(dá)/敲降的細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，siRNA敲降Rab5a、5c之后ALP染色陰性細(xì)胞率明顯上升。21天進(jìn)行的茜素紅染色和Vonkossa染色在Rab5過(guò)表達(dá)/敲降過(guò)程中均沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化。小鼠顱蓋骨siRNA注射之后，鈣黃素染色結(jié)果顯示Rab5a，Rab5c抑制組，骨形成速率減慢。從MicroCT結(jié)果顯示，小鼠顱蓋骨骨縫明顯加大，部分區(qū)域可見(jiàn)大片顱蓋骨